摘要:目的建立成年狨猴腎臟細胞體外培養的培養體系,并將Cas9編輯系統初步應用于所培養的狨猴腎臟細胞,建立檢測sgRNA切割活性的體系。方法取成年的狨猴腎臟,采用貼壁法、消化法得到狨猴腎臟細胞。對細胞進行生長曲線測定、轉染試劑(Viafect和Lipo2000)及抗性(嘌呤霉素和殺稻瘟菌素)濃度篩選,將SIRT1的sgRNA質粒和Cas9質粒共轉染狨猴細胞,提取基因組并對基因修飾目的片段擴增,并將擴增產物進行測序。結果建立狨猴腎臟細胞體外培養體系;ViaFect轉染試劑轉染率大于60%;細胞抗性篩選適宜濃度嘌呤霉素4μg/mL,殺稻瘟菌素8μg/mL;測序結果表明,從sgRNA的PAM序列附近開始出現突變峰,證明sgRNA成功引入突變。結論成功建立了狨猴腎臟細胞的體外培養、細胞轉染和抗性篩選體系;CRISPR/Cas9可以用于狨猴腎臟細胞編輯,為基因修飾狨猴靶點選擇提供依據。
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