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【關鍵詞】 生物醫學；動物；實驗
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.785 文章編號：1004-7484（2013）-09-5430-01
近年來，生物醫學研究工作發展迅猛，實驗動物在生物醫學研究中的作用也愈發突顯出來。實驗動物的應用領域非常廣泛，無論是在疾病的預防、診斷、治療方面還是藥品、器械的安全性評價方面都非常理想，為眾多生物醫學研究提供了可靠的保證。我國實驗動物應用發展日臻成熟，但是在實驗動物管理工作中仍存在許多問題。如實驗動物設施管理不規范、實驗動物和標準化的實驗環境及條件不規范等問題仍然十分普遍。這些問題不僅會對實驗結果的準確性、可靠性和重復性產生較大影響，同時也嚴重違反實驗動物福利原則。因此，建立系列的實驗動物管理規范、開放專業動物實驗室、創建動物實驗服務技術平臺等需要在今后的工作中逐步完善。
1 實驗動物應用規范化
規范的實驗動物模型的基本要求是能夠準確再現，對影響因素嚴格控制，保證各項指標的一致性。生物醫學研究中能夠影響實驗結果的因素主要有動物因素和環境因素，其中動物因素包括：遺傳、性別、年齡、健康狀況等；環境因素包括：營養、氣候、理化、居住等[1]。因此，規范實驗動物設施管理工作，對實驗結果的可靠性具有重要意義。
1.1 實驗動物設施規范建設 實驗動物科學是一門邊緣的、交叉的學科，需通多學科、多領域共同完成。在實驗動物設施建設中，實驗動物環境設施是核心任務，也是實驗生物的生存基礎。只有實驗動物設施規范建設工作規范化才能提高教學和科研的質量，保證實驗結果可靠。
實驗動物環境設施按照功能的不同可分為實驗生產設備和動物實驗設施；在兩種設施中根據空氣凈化程度要求的不同分為普通環境設施、屏障環境設施、隔離環境設施；三種設施環境又從安全性的角度劃分為正壓環境和負壓環境[2]，見表1。
1.2 實驗動物消毒管理 不同的實驗動物的飼養環境會不同程度地影響其生長發育情況及各項生理指標，這些因此都會影響到實驗結果的準確性。因此，對實驗動物飼養和實驗過程中的消毒工作提出了非常高的要求。通過合理的人流、物流、動物流和氣流安排，結合完善的消毒滅菌制度可以有效防止動物實驗中發生交叉污染，保證動物實驗的質量和可靠性。消毒工作[3]要以動物飼料、飲水、居住環境消毒為主，不斷加強及完善飼養人員的職業安全衛生防護措施，規范操作流程。
1.3 人員管理 我院在實驗動物管理中非常注重的工作人員的管理。動物實驗設施工作的人員必須經過嚴格的技能培訓與考核，能夠熟練地掌握實驗中的無菌操作和各種儀器設備的使用，并且嚴格執行標準操作規程（SOP），強化工作人員的無菌觀念。
2 實驗動物應用現狀
2.1 實驗動物種類和品系選擇 目前生物醫學研究選取的動物種類主要有：大鼠、小鼠、豬、犬、猴、兔、貓、豚鼠、果蠅、兩棲類和魚等[4]。各種動物所占的比例大概為：小鼠占38%左右，大鼠占25%左右，兔子占7%左右，犬占6%左右，其他特種占24%左右。在最新的調查中顯示：大鼠的使用率呈下降趨勢，小鼠的使用率在2002年首次超過大鼠；非哺乳動物的使用率逐步升高，魚和果蠅的使用量也有所增加，雞的使用率變化不大。
2.2 轉基因動物應用 轉基因動物（Transgenic Animals）是指可以用試驗導入的方法使其外源基因在染色體基因組內穩定的進行整合，并能通過遺傳復制給后代的動物。被導入動物基因組的外源基因被稱為轉基因（transgene）[5]。當外源基因在轉基因動物體內表達并培育出表型與人類相似的動物模型，就被稱為轉基因動物模型。
目前，許多疾病很難通過人工定向培育的方法獲得實驗動物模型。轉基因技術的出現為此提供了可能，轉基因技術可以在動物原有遺傳基因基礎上，通過改變基因的表達水平以模擬人類疾病的動物模型。轉基因動物模型產生疾病的原因清楚、模型動物的癥狀與人類相似。因此，轉基因疾病動物模型在實驗中的應用越來越廣泛。
3 總結
實驗動物對于人類健康的作用是不爭的事實，動物實驗是生物醫學研究領域中不可替代的技術之一。近年來，由于人類對動物保護意識的興起，實驗動物面臨嚴峻的倫理學問題日益突顯出來。因此，在動物實驗工作中要以人類健康為目的，在實驗過程中將對動物的傷害控制到最低程度才能符合社會的倫理道德要求。
另外，要積極開展實驗動物應用研究，規范實驗動物工作，不斷提高實驗動物質量，以滿足科研工作的快速發展；加強實驗動物技術人員的培訓和考核制度，定期對技術人員進行系統的學習和培訓，提高人員素質。
參考文獻
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在開展生物醫學研究時，研究者通過正確地運用統計學知識，可直接影響研究的質量。統計學設計的任務在于對研究的部署、實施，直到研究結果的解釋進行系統的安排，力爭做到以最少的人力、物力獲得可靠的結論和信息。其目的在于確定某種處理是否會表現出某種特定的效應。在實驗設計時應遵循惟一差異原則，即在進行兩組比較時，兩者之間僅有因處理因素不同而引起的差異，而其他實驗條件相關的非處理因素都應保持等同。然而，處理組與對照組在反應上表現出的差別并不一定意味著是處理的結果。另有兩種引起差別的可能性，即偏倚和偶然性。偏倚是指系統性差別，它不是因組間在處理上的不同所引起。生物醫學實驗中統計學設計和分析的目標就是消除潛在的偏倚，減少偶然性[2]。
1.1實驗的偏倚和控制
偏倚是在研究中從設計到實驗實施和結果分析的各環節存在一些人為的、有系統傾向的非隨機誤差，它不是由于抽樣造成的，而是某種偏性使得實驗結果偏離它的真值。從所選擇的生物醫學問題到研究方案的制訂與實施、實驗的完成過程、實驗的分析與解釋，乃至實驗結果的發表，均可能存在各式各樣的偏倚[2]。這種偏倚常常表現為系統誤差。偏倚的大小取決于研究的方法和具體的實驗條件。常見的偏倚主要有選擇性偏倚、觀察性偏倚和混雜性偏倚。必須認識實驗過程的偏倚，從實驗設計起直到整個研究過程結束均要加以控制。正確的實驗設計可控制選擇性的偏倚，事前人為控制和采取相應的措施可避免和減少觀察性的偏倚。對于混雜性偏倚，可將重要的混雜因素在設計階段進行分層隨機設計，使混雜因素在組間分布均衡；在統計分析階段將混雜因素作為分層因素或采用有協變量分析方法，以消除混雜因素的影響。只有有效地控制或消除偏倚，方可減少結果的假陽性或假陰性。
1.2減少偶然性的潛在影響
偶然性因素的作用可以減少，但不能完全排除。因為即使是在精心實施的研究中，接受同樣處理的動物，其反應也不可能完全一樣。適當的統計分析可使實驗人員評估出現假陽性的概率，即根本不存在處理效應的情況下觀察到差異的概率。這種概率越小，實驗者發現真實效應的可能性就越大。為了更有把握地檢測出真實效應，有必要減少偶然性的作用，并通過實驗設計確保能在“噪聲”之上識別真正的“信號”。
1.3實驗設計的要素
要消除生物醫學實驗中潛在的偏倚，減少偶然性，就應對實驗對象、處理因素和實驗效應這三個實驗設計要素，按照對照、重復、隨機化和均衡四項原則進行周到的設計與控制[3]。1.3.1實驗對象實驗中處理因素所作用的對象稱為實驗對象。不同性質的實驗研究需要選取不同種類的實驗對象，一個完整的實驗設計中所需實驗對象的總數稱為樣本含量。生物醫學試驗中考慮動物實驗對象時應關注以下幾個方面：①動物種屬的選擇：選擇實驗動物的種屬與品系時，尤其需要注意其背景反應的水平。為了將反應“信號”水平最大化，常常意味著應避免選擇那些背景反應水平極低的動物種屬或品系，但如果采用過度反應的動物種屬或品系也同樣會出現問題。動物物種選擇中的其他問題，無論是實際問題（壽命、體型、易得性、對動物學特征的了解情況）或是理論問題（生化、生理或解剖結構與人的相似性），都需要從專業的角度認真加以考慮和權衡。②動物的數量：雖然從統計設計角度考慮可得出某項實驗所需的動物數（樣本含量），但所得出的數值往往很大。因此，雖然樣本含量估計是保證結論可靠性（精度和檢驗效能）的前提，但基于實驗的可操作性及經濟原則方面的考慮，應結合統計學的計算結果與以往的生物醫學研究經驗予以確定。③動物的體重與年齡：為確保實驗對象的同質性，實驗中所使用的動物體重與年齡應盡可能相近；動物體重的標準差不應超出平均值的10%；嚙齒類等小動物年齡相差不應超出1周，大動物年齡相差不應超出1個月。④動物的分層：為了準確檢測一種處理因素引起的差別，各處理組在可能影響實驗結果的其他非處理因素方面應盡可能具有同質性。當存在動物亞系間的差別時，有兩種方法可得到更為準確的結論。一是在結果分析階段將亞系作為一個“分層變量”處理，包括對兩個亞系的結果進行單獨分析，然后將結果綜合，得出處理效應的總結論；二是將亞系作為實驗設計的“區組因素”，這種情況下可使對照組與處理組中每個亞系動物數量相等。除以上所討論的“亞系”之外，其他的非處理因素，如性別、窩別、體重段等也可作為分層變量進行局部控制，并據此進行分層隨機化分組。1.3.2處理因素設計實驗研究時，要明確研究中的處理因素和影響實驗效應的非處理因素。研究者希望通過對研究設計進行有計劃的安排，從而能科學地考察其效應大小的因素稱為處理因素或實驗因素；研究者往往忽略對評價實驗因素作用大小有一定干擾的重要的非處理因素或非實驗因素（如動物的窩別、體重等）；其他未加控制的許多因素的綜合作用統稱為實驗誤差。實驗結果是處理因素和非處理因素共同作用而產生的實驗效應，因此如何控制和排除非處理因素的干擾，正確顯示處理的效應，是實驗設計的基本任務。1.3.3實驗效應實驗效應是處理因素作用于受試對象的反應和結果，是反映實驗因素作用強弱的標志，它通過觀察指標（統計學常將指標稱為變量）來體現。如果指標選擇不當，未能準確反映處理因素的作用，獲得的研究結果就缺乏科學性，因此選擇好觀察指標是關系整個研究成敗的重要環節。指標的觀察應避免帶有偏性或偏倚，要結合專業知識，盡可能多地選用客觀性強的指標，在儀器和試劑允許的條件下，應盡可能多選用特異性強、靈敏度高、準確可靠的客觀指標。對一些半客觀（如尿液pH試紙讀數值）或主觀指標（行為測量、病理觀察），一定要事先規定讀取數值的嚴格標準，只有這樣才能準確地分析實驗結果，從而提高實驗結果的可信度。
1.4實驗設計的原則
為了防止結果的偏倚，保證實驗結果的準確性和最大化的表達，在進行生物醫學實驗設計時必須遵循統計學設計的對照、重復、隨機化和均衡四個基本原則。生物醫學實驗中對照組的設置必須具備三個條件：①對等原則，即惟一差別原則，除處理因素外，對照組具備與實驗組對等的非處理因素。在相互比較的各組間，除了給予的處理因素不同外，其他方面應與實驗組具有一致性，如相同的實驗單位來源（動物種屬、體重等）和相同的實驗條件、操作方式和喂養環境等。②同步原則，對照組與實驗組設立之后，在整個研究進程中始終處于同一空間和同一時間。③專設原則，任何一個對照組都是為相應的實驗組專門設立的。不得借用文獻上的記載或以往結果或其他研究資料作為本研究之對照。
1.5生物醫學中常用的實驗設計類型
如果需要在同一實驗中同時評價幾種不同的效應，實驗者應該安排能區別各自效應差別的實驗設計方法。生物醫學中常用的實驗設計有以下幾項。1.5.1完全隨機設計完全隨機設計是生物醫學動物實驗中最為常用的一種實驗設計方法，它是一種單因素有k個水平（k≥2）組的實驗設計。即實驗設計可設置一個對照或多個劑量組的實驗方案。本設計保證每個實驗動物都有相同機會接受任何一種處理，而不受實驗人員主觀傾向的影響。本設計應用了重復和隨機化兩個原則，因此能使實驗結果受非處理因素的影響基本一致，真實反映出實驗的處理效應。1.5.2隨機區組設計隨機化完全區組設計，簡稱隨機區組設計，又稱配伍組設計，是配對設計的擴展，它將幾個條件相同的受試者劃分在同一個區組或配伍組，然后再按隨機的原則，將同一配伍組的受試者隨機分配到各實驗組。該設計方法的優點是每個區組內的k個實驗單位有較好的同質性，比完全隨機設計更容易察覺處理間的差別。這種方法須特別注意的是要求區組內實驗單位數與處理數相同，實驗結果中若有缺失值，統計分析將損失部分信息。1.5.3拉丁方設計拉丁方設計從橫行和直列兩個方向進行雙重局部控制，使得橫行和直列兩向皆成區組，是比隨機區組設計多一個區組因素的設計。在拉丁方設計中，每一行或每一列都成為一個完全區組，而每一處理在每一行或每一列都只出現一次，也就是說，在拉丁方設計中，實驗處理數=橫行區組數=直列區組數=實驗處理的重復數。1.5.4析因設計析因實驗設計又稱全因子實驗設計，屬于多因素、多水平單效應的設計。它不僅可以檢驗每一因素各水平之間的效應差異，而且可以檢驗各因素之間的交互作用。交互作用是指一個因素不同水平間的效應差受另一因素的影響，包括協同交互作用和拮抗交互作用。析因實驗主要用于分析交互作用，當因素及水平數過多時，所需的實驗對象數、處理組數和實驗次數大幅度增加，故一般采用較簡單的析因實驗。含有較多因素和水平的實驗一般采用正交實驗設計[5]。
2生物醫學動物實驗的描述統計學
2.1生物醫學實驗資料的類型
生物醫學實驗對實驗對象（動物）進行干預后測定的觀測指標通常有以下類型：①連續性數據：測定結果表現為有數字大小和單位的數據，統計上稱定量資料，如生理、生化指標，體重值，器官重量等。②分類數據：測定結果表現為按某屬性劃分的定性類別，統計上稱為定性資料，具體又可以分為二值資料、多值名義資料和多值有序資料。如某反應為出現或不出現，死亡或未死亡，有畸形或無畸形；病理損害的嚴重程度（無、輕度、中度、重度）等。
2.2統計描述指標
描述性統計學（或歸納統計學）是對樣本觀察/測量數據頻率分布的定量研究，描述性統計的目的在于：①對測量值或觀察值進行歸納濃縮，用統計量、統計圖或統計表的形式表現；②估計總體分布的參數。2.2.1資料的整理與探索對于某一測量指標，一般應從文獻資料中了解其分布類型。如果沒有判斷概率分布的理論基礎，應重復以大樣本測定，繪制樣本的頻數分布圖（理論上樣本量要大于100），并經統計學檢驗擬合其分布。2.2.2數據的描述統計量①連續性數據的頻數分布：通過對樣本資料編制頻數分布表或做莖葉圖，以確定資料分布的類型、頻數分布的集中趨勢和離散趨勢、估計總體參數，也便于發現離群值。②中心位置的描述統計量：描述數據分布的集中趨勢，常用指標為算術均數、中位數、眾數、幾何均數等。③離散程度的描述統計量：描述數據分布的離散趨勢，常用指標為標準差和方差、極差和四分位數間距、變異系數和離散系數等。④統計學圖表：統計圖包括連續性數據分布的直方圖、莖葉圖，表示數據中心位置和離散程度的點桿圖（做圖時表示均數和標準差）和盒須圖（做圖時表示中位數、極差、四分位數間距），描述構成比數據資料的百分條圖、餅圖，描述經時變化趨勢的線圖，以及預測和檢驗分布類型的概率-概率圖（P-P圖）等[6]。統計表具有簡單、明了、易于理解、便于比較的優點。編制統計表時原則上應當重點突出、層次分明、避免層次過多或結構混亂。一般的統計表應為三線表，表中只有橫線，無豎線和斜線。統計表的標目應層次清楚，不宜過于復雜。
3生物醫學動物實驗的假設檢驗
生物醫學動物實驗中最常見的情況是給予不同受試物后進行組間比較，通過統計學中的假設檢驗，說明受試物的作用。假設檢驗時應注意以下問題。
3.1檢驗方法的選用依據
3.1.1資料的類型和變量的數目不同類型的資料（定量、定性）的組間比較應采用不同的統計檢驗方法。單變量、多變量的統計檢驗方法也各不相同。3.1.2實驗設計類型應該根據實驗設計的具體類型選擇對應的統計檢驗方法，以便得到處理組效應的真實結論。3.1.3檢驗方法的前提條件選用假設檢驗方法前，應了解所分析的數據資料是否滿足相應檢驗方法的前提條件，如t檢驗和方差分析等參數檢驗方法要求數據滿足正態性和方差齊性，χ2檢驗要求樣本含量大于40且理論頻數大于5。
3.2正態性檢驗及擬合優度檢驗
統計學假設檢驗須判定樣本的頻數分布是否符合某一理論分布，如符合要求就可按此理論分布來進行統計學處理。對正態分布可采用正態性檢驗，其他分布可用擬合優度檢驗。通常可通過查閱文獻，了解實驗參數符合何種理論分布。
3.3方差齊性檢驗
連續性數據未達到參數法統計分析前提的第二種原因即為方差不齊。一般而言，數值愈大，其固有的變異性也愈大。例如，若某組動物的平均反應值為100，其數值范圍可能為80~120；而另一組動物的平均反應值為300，其數值范圍可能會擴大至240~360。解決方差不齊的措施是進行數據轉換。若數據的標準差與平均值成正比，在統計分析前宜將數據轉換為對數值之后再進行分析，據此，不僅數據的變異度與平均值大小無關，同時還可確保其更符合正態分布。若數據變異度增加幅度與平均值的關系不太明顯，采用平方根轉換則更易使數據的變異度與平均值大小無關。某些數據經對數或平方根轉換后可能仍存在方差不齊，此時宜采用非參數檢驗。
3.4單側檢驗與雙側檢驗
檢驗假設選擇單側檢驗或雙側檢驗，應事先根據專業知識做出選擇。一般而言，若研究目的僅須了解是否存在組間差異、實驗者無法預測組間變化的方向以及實驗者希望獲得正負兩方面的結果時，應采用雙側檢驗。若事先可預測組間差異的變化方向，實驗者僅對某一方面的重要性感興趣，實驗者僅希望了解與對照組差異或正或負一個方向，則應采用單側檢驗。此外，劑量設計預試驗中應采用雙側檢驗，正式試驗在了解相關信息后可采用單側檢驗。
3.5多重比較及多重性問題
生物醫學實驗經常在處理組和對照組之間做多個變量的比較。即使不存在真正的實驗效應，也有可能純粹由于偶然性而有一個或多個變量在5%檢驗水平出現顯著性差別。除了上述均數多重比較導致Ⅰ類錯誤概率增加的多重性問題之外，其他的多重性問題還包括多次的中期分析、關注多個結局、亞組間的多重比較。處理多重性問題的原則包括：①預先計劃進行多重比較；②限制比較的次數；③多重比較時采用更嚴格的界值標準；④多重比較具有生物學方面的依據。
3.6觀察值或實驗對象的獨立性
許多統計檢驗方法要求比較的觀察值或實驗對象相互獨立，如二項分布的率檢驗、t檢驗和方差分析等。但是，有的生物醫學實驗中觀察單位并不獨立。例如，生殖和發育研究中就存在窩效應：由于遺傳因素、宮內的發育環境和藥物的代謝環境相似，與異窩胎仔相比，同窩胎仔之間對毒性效應的反應概率趨于系統，即同窩內數據為聚集性數據，這就是一種常見的非獨立數據。在統計學分析時，忽略數據的窩內相關性具有潛在的風險；因同窩母鼠所產k個胎仔的觀察值存在共性，其所提供的信息不及k個獨立的來自不同母鼠所產胎仔所提供的信息；窩內相關性愈大，其信息量愈少。聚集性數據的均數標準誤小于獨立的數據，因此，若基于觀察值獨立的統計分析方法，就會增加犯Ⅰ類錯誤的概率，即假陽性的風險增加，降低實驗的有效性。
3.7歷史對照數據的應用
某些情況下，尤其是在發生率較低的情況下，單項研究可能提示處理可影響腫瘤發生率，但無法得出明確的結論?？赡芟氲降姆治鲛k法之一是將處理組的數據與來自其他研究的對照組動物相比較。雖然歷史對照數據具有重要意義，但值得強調的是，眾多原因可導致不同研究之間的變異度大于研究之內的變異度。動物來源、飼料及飼養條件，研究期限，研究中的動物死亡率、讀片的病理學家等均可能影響最終的腫瘤發生率。故此，忽視這些差異，將處理組的腫瘤發生率與合并的對照組發生率相比較，可能得出嚴重錯誤的結果，并進而明顯夸大統計顯著性水平。Tarone[4]曾對歷史對照組的比率數據分析進行過綜述。
3.8假設檢驗的局限性
1.1生長與繁殖特性
寧鄉豬的繁殖期長，且繁育能力較強。公豬3月齡性成熟，5～6月齡可配種。母豬4月齡第一次，7～8月齡可配種，利用年限約8～10年。成年母豬的有效可達12只以上，每胎產活仔數8～12頭。
1.1.1種質特性朱吉等［1］發現寧鄉豬經營養物質條件的改善及飼養科學的適應性變化，肢蹄臥系率降低92.2%，體尺體重性狀和繁殖性狀提高率分別達6.97%～27.67%、11.62%～17.44%，窩重提高率達26.91%～78.97%，特別是閹豬的生長速度和胴體性能明顯提高。寧鄉豬母豬日增重表現為前期低、中期高、后期下降的生長曲線，閹豬表現為前期高、中期低、后期回升的生長曲線，閹豬和母豬都具有生長肥育期日增重曲線的相似性。后備公豬的體重及體尺指標不及同齡母豬，主要是性成熟過早所致。
1.1.2肥育性能Rorz指出，改變日糧組成分與結構可以減少3.2%～62%的氮排出。寧鄉豬與瘦肉型豬氮的消化利用能力存在差異，寧鄉豬12.91%蛋白質日糧組具有較好的能氮平衡性。研究表明在寧鄉豬生長肥育后期添加一定量的半胱胺可促進生長、提高胴體瘦肉率和改善豬肉品質。寧鄉豬雜交組合具有較高的生長速度和胴體品質。寧鄉豬生長肥育性能的可塑性較強，閹公豬的生長肥育性能優于母豬，優化飼糧是提高其肥育性能的基礎。寧鄉豬肥育期日增重與膘厚、肥育率呈正相關;胴體長與胴體寬、后腿重與腿臀圍呈強正相關，與肥肉率呈弱正相關，與瘦肉率呈弱負相關;眼肌面積與瘦肉率呈弱負相關，而與肥肉率呈弱正相關。最近研究表明由于寧鄉豬肥膘產量高，相對產值較低，所以55～85kg階段是寧鄉豬的最佳屠宰期。
1.1.3母豬營養需要研究表明寧鄉豬母豬妊娠前期、妊娠后期和哺乳期能源分別為37%～39%、22%～24%和39%～41%，相應的日攝食標準消化能分別為18.9MJ、27.0MJ和45.5MJ，粗蛋白質分別為156g、242g、538g;提高母豬哺乳期采食量是節省能量、提高仔豬增重的重要途徑，補飼青料可提高母豬的飼料利用率。近期研究表明14%以上的日糧蛋白水平有利于促進寧鄉豬母豬的生長發育［7］。
1.2生理、生化指標研究表明寧鄉豬白細胞總數、紅細胞體積、淋巴細胞計數及血小板均低于三元豬;甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白與血清甲狀腺素T3含量高于三元豬，血清甲狀腺素T4和胰高血糖素含量下限值低于、上限值高于三元豬，血清葡萄糖含量低于三元豬可能與胰島素含量高于、胰高血糖素低于三元豬有關。與近交系五指山小型豬、廣西巴馬豬和貴州小型豬等國內小型豬相比，寧鄉豬的堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、低密度脂蛋白-膽固醇和總膽固醇較高，而γ-谷氨酰轉移酶、三酰甘油、肌酐和高密度脂蛋白-膽固醇較低;與杜洛克豬、長白豬、大約克夏豬等國外引進品種豬相比，寧鄉豬的丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶明顯較高，總膽固醇明顯較低，γ-谷氨酰轉移酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、葡萄糖相差不大［9］。郭潔平等［10］研究發現與長白豬相比，寧鄉豬血清精氨酸、一氧化氮濃度較低，空腸前段和肝臟一氧化氮合成酶活性較高，腎臟中的一氧化氮合成酶活性最低，腸道和肝臟中N-乙酰谷氨酸合成酶mRNA表達水平最高。
1.3病理特性研究發現豬流感(H3)誘發寧鄉豬高熱病病理變化主要在呼吸器官，表現為氣管、支氣管充血，肺腫大，小葉間質增寬，肺尖葉有實質病變，腸胃出現卡他炎癥、彌漫性出血。外來良種豬及其三元雜交、二元雜交生豬發病嚴重，死亡率高，寧鄉豬及其與外來良種豬的雜交后病癥狀較輕，治療也容易一些，有的生豬甚至不治而康復，死亡率也相對較低［12］。
1.4肉質性狀寧鄉豬肌纖維纖細，紋理間脂肪分布豐富均勻，肉質細嫩，肉味鮮美，是北京奧運會唯一指定豬肉產品。根據營養需要推薦飼養標準配制日糧，測定肌肉常規成分、氨基酸、脂肪酸和礦物元素，發現寧鄉豬肌肉內脂肪為5.37%，風味氨基酸高達220.5%，必需氨基酸高達122.4%，油酸(18:1)51.0%，亞油酸(18:2)7.74%，不飽和脂肪酸59.6%，是與深海魚油媲美的保健食品。寧鄉豬和三元豬鮮味氨基酸、必需氨基酸和氨基酸總量差異不顯著［1，13］。目前開展了寧鄉豬與商品瘦肉型豬生長激素基因功能比較研究，王文策等選用了融合表達載體構建寧鄉豬生長激素的原核表達質粒，成功構建重組原核表達質粒pET-GH。
1.5遺傳學特性研究發現寧鄉豬二、四、六月齡時體重變異系數均在16.28%以上，體長、胸圍、腿臀圍變異系數為5.66%～8.55%。寧鄉豬的體長與胸圍的遺傳相關系數為0.43，表型相關系數為0.74，這與寧鄉豬屬于脂防型豬種、具有邊長邊肥的特點有關。寧鄉豬頭長、額寬、腿臀圍、體高具有高遺傳力，頭長、額寬表型變量受環境偏差的影響較小。寧鄉豬的變異系數較小，產仔數、產活仔數、初生重、泌乳力、斷奶重等性狀的變異系數較大。寧鄉豬毛色是品種特征和遺傳穩定性的標志;與瘦肉量相關系數最高的是后腿重。研究發現TLR6基因片段MspI酶切位點的兩種等位基因T/C的頻率分別為0.186/0.814，TT基因型個體顯著影響4月齡體質量性狀，TT基因型4月齡體質量比CC型高25.92%;TT基因型個體顯著影響45日齡體質量、6月齡體質量、體長和胸圍性狀，TT基因型45日齡體質量比CC型高12.46%，結果提示寧鄉豬TLR6基因不同基因型對生長性狀有著重要的影響，是寧鄉豬育種應用中的一個潛在遺傳標記。
2實驗寧鄉豬在生物醫學研究領域中的應用
2.1實驗寧鄉豬應用于醫學研究的優點研究顯示靈長類、犬、貓等在動物實驗研究中受到倫理限制，而豬被認為是研究人類疾病最合適的實驗動物。既經濟實用，又克服了同種器官的短缺。豬心血管系統的解剖、生理特征和對致動脈粥樣硬化食物的反應與人類高度一致，成為心血管疾病研究的標準模型動物;豬腎臟的解剖和生理功能幾乎是人類的復制品;豬也是皮膚和整形外科手術、皮膚燒傷等較理想的模型動物;小型豬還是皮膚黑色素瘤研究的首選實驗動物。剛出生的或剖腹產得到的仔豬，是進行抗原抗體反應很好的模型動物，小型豬也是人類異種移植理想的組織、器官來源，可作為異種移植排斥反應的模型。
2.2實驗寧鄉豬在生物醫學研究中的應用最近研究發現原代寧鄉豬與其第一代仔豬13項血液生理指標如白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞積壓及部分血液生化指標如總膽紅素、尿素氮、總蛋白等有顯著性差異，為寧鄉豬實驗動物化研究提供了參考數據。研究發現寧鄉豬與人N-乙酰谷氨酸合成酶氨基酸序列同源性高達93.2%，與小鼠同源性達90.76%，為內源性精氨酸的營養調節提供一個新的途徑。趙拴平等發現寧鄉豬的總蛋白、三酰甘油、尿素氮、葡萄糖等血液生化指標都處于人參考值范圍內，堿性磷酸酶、總膽固醇均高于人參考值范圍。耿梅梅等還發現，門靜脈灌注葡萄糖可使寧鄉豬血糖短期升高，白蛋白、低密度脂蛋白及α-淀粉酶活性下降，經機體代謝，上述指標逐漸恢復，但尿素氮、高密度脂蛋白、堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶的活性基本無變化。研究還發現寧鄉豬與瘦肉型豬相比有不同的代謝，包括脂肪生成、脂質過氧化、能源利用和分區、蛋白質和氨基酸代謝、胃腸道微生物的發酵，肥胖寧鄉豬可能是兒童肥胖研究的有用模型，也可能是研究動脈粥樣硬化、糖尿病有利模型。寧鄉豬完整線粒體基因組序列為有關遺傳機制的進一步研究提供重要數據，但研究還表明寧鄉豬可能不宜作為異種移植的適當供體。
3展望
關鍵詞：醫學實驗動物學；教學內容；教學方法；考核評價機制
中圖分類號：G424文獻標識碼：A文章編號：1674-9324（2018）02-0272-02
高等醫學院?！夺t學實驗動物學》是碩士研究生必修課程之一，它是進行基礎醫學研究的基本課程。據相關調查顯示，生物學和醫學中60—70%的課題要選用合適的實驗動物進行相關研究；而藥理學、生理學、病理學實驗和外科學實驗等超過70%科研研究領域需要實驗動物參與實驗[1-2]；此外，實驗動物廣泛應用于教學培訓、醫學研究、藥品、生物制品、食品等功能及安全性評價領域[3-4]。實驗動物學作為一門獨特的學科對生命科學領域研究起著越來越重要的作用。
《醫學實驗動物學》課程如此重要，因此，如何做好這門課程的教學工作給授課教師提出了更高的要求。結合近年來實驗動物在使用過程中出現的一些問題，我們對動物實驗課教學從調整教學內容、改進教學方法、改革考核方式等方面做出相應的改革。經過兩輪的教學改革取得了良好的教學效果，充分調動了學生學習的積極性和求知欲，培養了學生嚴謹、科學的學習態度，切實提高了學生的基本操作技能，激發了學生學習的主動性，培養了從發現問題、分析問題到解決問題的科學研究思路，增強了團隊協作意識及能力，全面調高了研究生教學質量。在此，我們結合近2年對碩士研究生《醫學實驗動物學》的教學改革情況，對我校遵義醫學院珠海校區本門課程的教學進行相關教學總結，希望進一步促進醫學實驗動物學教學改革。
一、優化教學內容，理論與實驗整合優化
摒棄“灌輸式”教育模式，將20學時的理論教學降至16學時。我們充分利用學校研究生網絡教學平臺、理論課程其他相關教學內容課件以“學習筆記”形式進行網絡教學。我們將教材中所列10個章節理論教學分為五大專題進行教學：專題一，實驗動物在生命科學領域重要作用；專題二，動物福利與動物倫理；專題三，實驗動物基本操作技術；專題四，人類疾病動物模型；專題五，基因工程動物與轉基因動物的建立。這五大模塊從不同的角度展示了作為醫學生應具備的基本知識。而實驗教學內容，則由16學時增為32學時，實驗教學將分為基礎性實驗、綜合性實驗和設計性實驗這種“三步法”教學來與理論相呼應，進一步將理論融入到實踐中，在嚴格遵循“3R”原則的前提下提高學生的動手操作能力。我們本著“不放棄教材，但不局限于教材”的原則，根據專題實驗的需要，精選教材中相關的章節進行講述；對于教材中沒有及時更新或沒有詳細闡述的部分，借助互聯網資源進行適當補充，做到有的放矢。
二、采用多元化教學方法
我們采用視頻教學、PBL教學和網絡教學平臺相結合的多元教學方法。首先，在實驗教學過程中貫徹實驗動物福利“3R”原則和動物倫理觀，規范實驗操作。實驗課中倡導和強化實驗動物福利倫理觀念是實驗動物學教學改革必不可少的環節之一，將動物福利觀落實到具體實驗操作如抓取、保定、給藥、采血、處死等各環節中，善待動物，及時制止并糾正學生不規范操作，對于虐待動物者給予批評警告并納入期末成績考核。
其次，我們在教學中部分專題還引入“PBL”教學模式，以學生為主體，以問題為中心，在教師的整體把握和指導下，強調學生的主動參與[5-6]。比如，在動物福利這個專題中，我們引入“如何理解動物福利”、“動物解放表現在哪些方面”、“道德進步與動物福利的關系”、“我們在實驗中應該如何合理對待動物”以及“動物應激反應與實驗結果關系”等問題，通過實驗操作及實驗體會分組進行相關討論，并寫出相關匯報，以加深對動物福利的理解與認識，通過“問題式探討”激發學生學習興趣，增強其自主查閱文獻、收集資料等能力。學生是教學中的主體，是教學最終成果的體現者，只有保證學生成為這樣的角色，才能實現最終的教學目的。教師角色也發生了轉變，由知識的傳授者、灌輸者、知識權威、教學中心，轉變為教學活動的組織者、引導者、參與者和研究者，這樣，在教與學的矛盾中，才能促使教師成為創新教學的主要方面，使其正確地把握創新教學的方向。
此外，我們還利用網絡資源及購買的實驗教學視頻進行直觀教學，參考資料有武漢大學實驗動物中心錄制的“實驗動物”；國外動物福利組織提供的“共享世界”；國家衛生部錄制的“動物基本操作技術”、“動物模型基本病理過程”、“顯微注射法建立轉基因動物”；錢永祥與梁文道關于“動物倫理與道德進步”的學習視頻等。多元化教學方法的應用使教學過程形象化、直觀化，達到了文字語言描述難以達到的效果，便于學生進行觀察和思考，利于學生分析問題和解決問題。
三、構建合理的考核評價機制
我們根據學生實際情況，制定評價考核表，從規范操作動手能力評價、創新能力評價、團隊合作能力評價、科研寫作能力評價等方面進行考核[7]（參考表1）。通過實驗考核評價體系綜合評定學生學習能力，符合大部分學生的意愿，同時培養了學生獨立思考問題的能力。其次，請專家組老師深入課堂進行教學評估。最后在課程結束后進行相關問卷調查（表2）。調查結果顯示：98%的同學認為教學改革有助于提高其實驗操作技能和科研能力，能提高其分析問題和解決問題的能力；95%的同學認為可以激發其興趣和主動性，增強其團隊協作能力；94%的同學認為教學改革拓寬了他們的知識面；100%的同學對教學方法滿意，認可教學改革。改革也仍有需要改進的方面，比如，鍛煉學生的表達能力和寫作能力，以及增強師生間互動這三方面體現得不是很好。今后將尋求可行的方法提高以上幾個方面的效果。
四、結語
通過對《醫學實驗動物學》課程中理論與實驗學時的整合優化，使理論知識與實驗內容更加緊密地結合，有助于學生對知識理解的融會貫通，學生也更能從動物的角度考慮它們應享有的權益，從心里油然而生一種敬畏之情；通過對實驗內容的適當擴充，形成相對完整的專題，增加了動手操作機會，培養學生整體的科研思維觀和全面的實驗操作協調能力，掌握基本科研思路從發現問題、提出問題到設計實驗、解決問題四步法著手去構建科研課題研究框架；通過多元化教學方法激發學生學習興趣和提高其自主學習能力，興趣和主動性是科研的開始；通過完善的考核方式更合理地從學習態度、創新思維、動手操作、團隊協作及自主學習5大方面衡量學生的綜合能力，促進學生個性化發展，同時有利于充分提高該課程研究生教學效果。另外，通過解決和應對專題實驗教學中出現的新問題，提高任課教師的整體素質，促進實驗動物學課程的建設和完善。我們也希望能在不斷進行教學革新基礎上，申請教改項目來引入更多實踐教學，構建合理的課程體系，在更大程度上促進實驗動物學的課程建設和發展，進一步推進產學研一體化，培養出真正合格的研究生。
作者：張青峰
參考文獻：
[1]崔淑芳，陳學進等，實驗動物學[M].上海：第二軍醫大學出版社，2013.
[2]師長宏，張海，王四旺等.三維醫學實驗動物學教學體系的建立[J].基礎醫學教育，2012，14（4）：289-291.
[3]王芳.醫學實驗動物學實驗教學與科研的有機結合[J].基礎醫學教育.2013.（11）：1016-1018.
[4]宋國華，劉田福，陳朝陽，王春芳等.醫學實驗動物學教學內容與方法的探討與改進[J].基礎醫學教育，2012，（10）：781-783.
[5]王蕭，郭學軍，張永斌.中醫院校研究生實驗動物學教學的體會與思考[J].西北醫學教育，2013，21（1）：76-78.
1 動物替代研究概論
1.1 概念
動物替代研究又被叫做非動物研究，具體是指使用替換活體動物的方法，實現生命科學和相關的研究來驗證實驗目的。動物替代的研究理論為三R原則，即替代、減少、優化[1]。主要內容有：減少對于動物的使用數量和使用時間；使用非動物模型代替動物模型；優化動物的運用方式，減少動物不必要的疼痛和不適應。
1.2 動物替代的分類
按研究范圍進行劃分，動物替代主要有兩個方面：動物檢測替代和動物使用替代。第一，動物檢測替代。在應用程序方面，使用體外檢測的方式替代之前動物整體的檢測方式，如組織人員進行技術培訓或使用數學模型等，積極提倡在科學研究或者實驗室試驗的過程中代替動物檢測的方式。第二，在研究、檢查和授課中靈活運用代替動物的方式，來獲得同樣的目的。實驗動物替代的層次可劃分為不同等級：一是非生物替代，是指運用數理化和計算機等方式替代；二是發育程度低的動物替育高的動物，如使用昆蟲等小型動物代替；三是減少型替代，減少對于實驗動物的使用時間和次數；四是優化型替代，如果必須要使用動物來進行試驗同時還沒有其他的方法時，就需要優化實驗過程，將動物從開始的運輸到埋葬尸體結束的全部過程。
1.3 動物實驗替代法的準用程序
想要使用一種新的實驗方法，需要經過建立到審批的全過程。第一，替代法的建立需要有一個完整的替代構架以及應用價值；第二，優化研究方法，可以很好地探測到實驗物體內的生命體征；第三，進行多個實驗驗證，即在不同的時間、地點使用替代法的實用性、可靠性和重復性；第四，同行評價，獨立評價替代方法的實用性、可靠性和重復性；第五，將新的實驗方法上交國家審核，按照相關的規定審核，通過后才可以使用。
1.4 替代法的必要性
對于動物的替代研究，在社會中具有多方面的價值。第一，動物替代法滿足人道倫理的發展需要；第二，大大減少了實驗過程中動物的經費；第三，使醫學實驗授課向更人性化的方向發展；第四，將實驗變得更加合理，還能與人類疾病相接近，避免實驗動物的不確定性，促進醫學研究的發展。
2 國外動物替代研究起源和發展現狀
2.1 國外動物替代研究發起源
國外的動物替代源自于英國，并最早提出三R原則，當時被認為這個領域的代表。二十世紀七十年代，英國的基金協會在傳播3R原則中作出了巨大的貢獻。在2013年，英國首個教育和研究合作組啟動，呼吁科學家們一起尋找動物替代法，為了能夠符合常理和治療措施等的實驗方法，這件事情被醫學界視為重要的里程碑。
2.2 機構建立
全球的替代研究組織多位于英國、美國和歐洲發達國家、地區。根據毒性測試非動物方法網站ALTTOX的更新消息，截至2015年，歐洲替代研究機構一共有47個[2]，主要分布于英國、德國、荷蘭、法國、意大利和比利時等多個國家。美國的替代研究機構有24個，亞太地區和南美等國家動物替代機構位于澳大利亞、巴西、加拿大、日本、韓國。
2.3 人性化的替代
歐洲的人性化教育網絡建立于1988年，在2000年變更成國際人性化教育網絡，提倡愛護廣大人士，在生物科學、醫學獸醫教育學中對于動物使用替代的方法。美國的國家反活體解剖學會一直致力于建設愛護生命，尊重世界，禁止科學界濫用動物的實驗。
2.4 出臺相關的法律
2007年歐盟對于化學品實施了監管系統，名為《化學品的注冊、評估、授權和限制》，簡稱REACH法規。其宗旨是保護人類健康和環境的安全，研制無毒無害化合物的創新能力，增加化學品的使用透明度，促進非動物實驗，追求可續發展的要求。歐盟是第一個禁止化妝品動物實驗的地區，隨后巴西等國家也借鑒歐盟的法律制定了相關的法律。
3 我國動物替代研究現狀
通過對相關文獻的查找，在知網中搜索有關研究的信息，并結合相關的法律、醫學方面的教育和替代研究方法的文獻，對其急性定性描述概括。對于替代方法的研究主要包括以下幾點內容：毒理學檢測、化妝品毒性檢測、眼刺激實驗替代方法；動物模型的替代，和體外實驗替代動物的整體實驗；藥物反應和動物實驗授課等。
廣州在2010年成立了中國替代方法研究評價中心，并建設了網站，為中國的替代法技術和研究信息的傳遞提供良好的交流橋梁，其中最主要的目的是：第一，宣傳、普及、分享、推廣3R理念和動物替代方法；第二，對于科學家的實驗起到間接的幫助作用；第三，網上咨詢有關動物替代的內容；第四，推廣3R原則，讓大眾了解和認可3R技術，對于體外實驗方法的交流和研討；第五，使得國內外的各醫學動物替代研究所可以良好地交流和溝通，還能從中吸取經驗和技術。2007年，北京實驗動物學會建立了實驗動物替代法研究會，同時還設立了雜志欄，為人們介紹外國實驗室的3R研究技術和在各種學術中的靈活使用。
4 結語
動物替代的研究隨著時代的進步在不斷地發展和進步，尤其是關于一些細胞等相關的研究在計算機的輔助下進行，之前的活體動物研究現如今都可以使用體外的方法試驗。我國的一些實驗室和相關的研發人員在生物制藥和研發等實驗都進行了深入的研究，但和發達國家相比，研究的內容相當有限，這種替代方法仍處于逐漸摸索的階段，在各個方面都有些落后于發達國家。
為了發展我國的替代方法，可以借鑒國外先進的研究組織或者管理方面的知識和技術，還要成立醫學動物替代法的研究機構，方便各方信息的傳遞。同時還要鼓勵動物替代實驗的方法的討論和教育，建立相關的動物替代實驗課程視頻和書籍等，但是要保證醫學生的替代解剖課的權利，推廣使用非動物的實驗法，使我國的科學研究有一個良好的發展方向，為人類、動物和大自然提供良好的生存環境。
參考文獻
[1]衛茂玲.醫學動物替代研究發展現狀研究[J].中國醫學倫理學，2016，29（2）：304-307.
[關鍵詞]野生動物醫學 野生動物保護 獸醫學 疫病防治
[中圖分類號] G643 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-3437（2015）11-0129-02
野生動物醫學不是一個獨立的學科，它是獸醫學和野生動物保護學的一個交叉學科，以野生動物為研究對象，以野生動物疾病防治為研究內容。野生動物醫學在我國作為一個新興的交叉學科，其研究生的培養還沒有形成自己的獨立體系，在國務院學位委員會頒布的學科目錄中還沒有野生動物醫學這個學科。野生動物醫學研究生的招生培養需要借助野生動植物保護與利用、生物學等學科平臺進行。
一、野生動物醫學方向的研究生將成為野生動物疫源疫病防控和野生動物救護領域的研究型或者綜合型人才
野生動物醫學的研究生教育是對動物醫學、野生動物保護專業的本科生在野生動物疾病研究基礎上作更高層次的培養。動物醫學本科專業的學生在大學期間主要學習的是動物疾病防治方面的基礎知識及其在動物疾病防治方面的初步應用，對于野生動物保護相關的知識內容學習得并不深入。野生動物保護本科專業的學生在大學期間主要學習野生動物保護、自然保護區管理方面的一些基礎知識，對野生動物疾病方面的知識只作一個大概的了解。而野生動物醫學的研究生就在要在研究生學習階段將這兩個不同專業體系的知識有機的融合在一起，培養既熟悉動物疫病防治理論又掌握野生動物保護知識的跨學科體系的研究型或者綜合型人才。
研究型野生動物醫學研究生側重對野生動物疫病發生發展規律的研究，在對病原體特征進行深入研究后，結合發病野生動物的行為特征，提出疫情、疫病防控的綜合措施。該類型的研究生要重點培養其創新意識和創新精神，為將來野生動物疫病防治領域基礎研究做人才儲備。野生動物醫學研究型研究生可按照科學碩士進行招生培養，鼓勵他們繼續進行博士學習，并最終將野生動物疫病研究作為其終生的職業。
綜合型野生動物醫學研究生要以野生動物保護具體工作單位或者特種經濟動物養殖行業的需要為培養出發點，通過自身的專業知識和操作技能，提高基層野生動物保護工作者或者特種經濟動物養殖者的業務水平，提升動物疫病防控和野生動物救護能力。該類型的研究生要重點培養其組織協調和解決實際問題的能力。野生動物醫學綜合型研究生可按照專業學位碩士進行招生培養，要創造條件讓他們多與相關生產實踐單位接觸，了解相關生產實踐單位在動物疫源疫病防控和野生動物中遇到的問題，有目的開展相應的研究試驗，以便將來在工作中解決這些問題。
二、野生動物醫學研究生人才的培養
（一）對于研究生的培養，不再以教師傳授基本的學科知識為首要任務。研究生授課體系應該具有培養學生的專業理念素養、自主獲取知識的功能。對于野生動物醫學研究生，應將科學的野生動物保護觀根植于心，熟悉國際、國內野生動物保護行業的現狀，使學生明白其從事的科學研究工作是服務于野生動物保護、改善生態環境、提高人民生活質量這個根本的大局，有著重要的政治、經濟、人文意義。
（二）野生動物行業有其特殊性，在進行野生動物相關工作的時候會受到相關法律法規的約束。作為野生動物高級人才，野生動物醫學的研究生一定要熟悉與野生動物相關的國際、國內法律法規。適用我國野生動物和利用的法律法規有《國家重點保護野生動物名錄》《有重要經濟價值和科學研究價值的野生動物名錄》《中華人民共和國野生動物保護法》《中華人民共和國陸生野生動物保護實施條例》《中華人民共和國動物防疫法》《中華人民共和國進出境動植物檢疫法》《中華人民共和國進出境動植物檢疫法實施條例》《中華人民共和國進出境動物一類、二類傳染病》《進境動物和動物產品風險分析管理規定》《瀕危野生動植物種國際貿易公約》。
（三）野生動物醫學研究生需要結合獸醫學和野生動物保護學兩個學科體系的知識進行培養，需要建立跨學科的課程體系。在培養野生動物醫學研究生的過程中，課程體系應該圍繞“野生動物疾病防治”這個核心點，建立“獸醫學”和“野生動物保護”這兩個課程模塊供學生選擇。本科為動物醫學背景的同學應該選擇“野生動物保護”這個模塊中設立的課程，本科為野生動物保護背景的同學應該選擇“獸醫學”這個模塊中設立的課程。但無論是“獸醫學”還是“野生動物保護”模塊中的課程體系，都不能簡單的照搬各自本科專業的課程設置模式，也不能采用本科階段的授課方式。
研究生要重點培養其自學能力，在課程設置和授課過程中不需要全面系統的講述，只需要給學生點出各種課程核心內容即可，按照“師傅領進門，學藝靠個人”的觀念進行授課?！矮F醫學”模塊體系，可借鑒獸醫學一級學科的分類法，分為基礎獸醫學、預防獸醫學、臨床獸醫學三大綜合課程?！耙吧鷦游锉Ｗo”模塊設置野生動物管理學、生態學、動物學這三大綜合課程。
基礎獸醫學重點講述怎樣應用生理學、病理學、藥理學知識闡述發病機制，診斷具體疾病，指導用藥施治，通過例證法使學生掌握這幾門課程的用途即可，而這幾門課程系統的理論和概念，包括解剖學、組織胚胎學可由學生根據實際情況自學。
預防獸醫學重點講述病原體（微生物、寄生蟲）在傳染性疾病發生過程中所起到的核心作用，可通過幾個重要的疾病如禽流感、血吸蟲病對野生動物及人類自身的影響來講述。
1適配體及其優點
適配體的概念在1990年由Tuerk等首次提出,來源于拉丁語“aptus”,即“匹配”的意思,指能結合蛋白或其他小分子物質的單鏈或雙鏈寡核苷酸片段。研究表明,在一定環境下,單鏈DNA或RNA能與某些物質形成多種熱力學穩定的三維空間結構而成為各種功能分子。在大多數情況下,溶液中的單鏈DNA或RNA的空間構象是不確定的,當有目標分子存在時,在合適的環境下寡聚單鏈會發生適應性折疊,形成發夾(hairpin)、假結(pseudoknot)、凸環(bulge)、G-四分體(G-quartet)等特殊結構,通過氫鍵、疏水堆積作用、范德華力等與目標分子緊密結合[1]。研究者們在單鏈DNA或RNA自身形成的空間結構與目標分子高效特異結合的基礎上,建立隨機寡核苷酸文庫,將該庫中的核苷酸序列與目標分子混合,用洗脫、過濾、親和色譜、磁性微球等方法篩選出與其特異性結合的核苷酸片段,再通過PCR進行擴增,經多個循環分離得到親和力和特異性都最高的寡核苷酸結合序列[2]。篩選出的寡核苷酸片段被稱為適配體,與適配體能進行特異性結合的目標分子稱為配體(ligand)。
與傳統抗體相比,適配體具有以下優點。①靶標廣。適配體可以與小分子物質如氨基酸、金屬離子、輔助因子FMN、核苷等結合,也可以是藥物、類固醇、糖類等,甚至是完整的細胞、病毒和細菌等結合,拓寬了其應用范圍。②有高親和性和特異性。
核酸適配體只識別與其互補的分子空間結構,能夠分辨出靶分子結構上的細微差別,比如相差一個甲基或一個羥基或D/L鏡像體之間的區別等。同時核酸適配體與靶分子結合的解離常數(kd)可以達到納摩爾甚至皮摩爾水平,具有比抗體或其他類型配基更高的親和力和特異性,有的甚至高于天然配體[3],幾乎可以完全避免非特異性結合。如茶堿與其他黃嘌呤類似物咖啡因、可可堿的結構非常相似,常規的茶堿單抗與后兩者有交叉反應,而核酸適配體只特異結合茶堿,與其他兩種物質無反應,且與茶堿的親和力比與咖啡因高10000倍。③可以大量、快速地在體外合成,篩選制備簡單快速,結構易改造與修飾。2001年Cox等[4]成功地建立了適配體自動化篩選平臺,篩選到了溶菌酶的適配體。篩選流程包括:通過鏈霉親和素(SA)與生物素的相互作用將生物素化的靶蛋白固定在磁珠上,隨后特異結合序列的分離,RT-PCR擴增和轉錄都通過設定的程序自動化完成,最后將篩選得到的序列克隆到載體中進行測序鑒定。2002年又做了進一步改進[5],直接利用基因體外轉錄與翻譯的方法產生靶蛋白。④穩定性優于抗體,利于儲存。核酸適配體在親和力和特異性方面可與抗體媲美,甚至優于抗體,并且具有抗體所不具備的其他一些優點[6]。⑤具有低免疫原性,能干擾靶蛋白質之間的相互作用。核酸適配體不具有免疫原性,預臨床試驗結果顯示,即使應用劑量高于治療劑量的1000倍[7],也不會引起免疫反應,沒有明顯的毒性和副作用。
2適配體的研究現狀
2.1治療藥物的選擇
理論上,適配體可以被用于治療任何由有害基因的表達而引起的疾病,如病毒感染、癌增長和炎性疾病等。核酸適配體作為治療藥物的研究始于20世紀90年代,首先被證明具有治療功能的適配體是抗血管內皮生長因子適配體,也是適配體治療藥物中最成功的一例,后來被EyetechPharmaceuticals公司和Pfizer公司共同開發為一種治療濕性老年性黃斑變性藥物,已經通過第三階段臨床試驗[8]。
此后,適配體作為治療藥物在生物醫學領域得到了廣泛推進,并深入到各個領域,如心血管疾病治療、腫瘤的顯像和治療、流感病毒的檢測和治療藥物等各個方面。近年來,核酸適配體類抗病毒藥物的篩選研究進行得尤其迅速,如通過篩選抑制A20蛋白適配體來抑制牛痘病毒的復制[9],丙型肝炎病毒RNA復制子的適配體的篩選[10]及抗HIV藥物篩選等。其中,對抗HIV適配體類藥物的研究最多,如Kissel等[11]通過抑制HIV-1逆轉錄酶制備的適配體、Hannoush等[12]通過抑制HIV-1核糖核酸酶H制備的適配體及Katahira等[13]通過抑制HIV-1Tat蛋白介導的反式激活制備的核酸適配體等。
2.2小分子物質檢測
人們設計出各種新型的生物傳感器來檢測金屬離子、藥物、核酸、蛋白質和細胞等小分子物質,并通過熒光染料、熒光共軛高聚物、納米粒子、電化學活性探針等材料以及核酸的級數擴增特性、核酶的催化活性及鏡像適配體的手性識別特性等多種形式增加檢測靈敏度?；谶m配體的檢測技術也令人振奮,如熒光染料TOTO常溫下直接與適配體混合即完成“標記”而用于靶分子檢測[14],基于適配體的生物傳感器可達到“無試劑、可再生、超敏感”的靶分子檢測新要求[15]。McCauley等[16]以核酸適配體制成生物芯片,能同時、定量、特異地檢出3種混于血清和細胞提取物中的腫瘤相關蛋白(次黃嘌呤單磷酸脫氫酶Ⅱ、血管內皮生長因子和堿性成纖維生長因子),顯示出良好的特異性和應用前景。
目前已開發了基于適配體的比色、熒光及電化學等方法,用于各種疾病相關蛋白質的檢測。Wang等[17]利用硅納米顆粒與金電極技術結合,將適配體應用到電化學生物傳感器上,采用競爭模式對凝血酶蛋白進行了定量檢測,檢測限可達1.0×10-12mol/L。2006年我國徒永華等[18]利用凝血酶的2條核酸適配體與凝血酶的高親和力構建了三明治結構,利用磁性納米顆粒的磁性分離技術,設計并制作了一種新型的熒光納米生物傳感器,用其檢測凝血酶,具有很高的特異性和靈敏度。由于目標分子在適配體上精確的結合位點與構象變化通常并不十分清楚,直接導致合適標記核酸適配體存在一定的難度。因此,適配體的無標記型檢測技術已經成為近年來的研究熱點,尤其在生物檢測、環境監控等領域具有非常重要的意義。
2.3基因調控領域
適配體可通過與靶位點結合而影響生物體的遺傳功能,適配體可以直接在轉錄和翻譯兩個水平上對基因表達產物進行調控。適配體通過對構成表達體系中的各類因子的作用,抑制或激活調控蛋白的活性來影響mRNA或蛋白質的表達量。或將適配體作為調控元件插入到表達體系中,通過適配體與靶分子結合時的變構效應,影響蛋白質最終表達,從而對蛋白質的功能進行調控。LXRs是肝中膽固醇逆向轉運調節的一種重要因子,它通過干預機體內眾多膽固醇調節蛋白的表達量來調節血液中膽固醇代謝。Surugiu-warnmark等[19]通過體外篩選技術篩選到一種LXRs受體抑制劑,該適配體能有效地降低LXR-α和LXR-β受體濃度,通過控制脂肪酸的合成和高密度脂蛋白的組裝來調節膽固醇的合成。該適配體是一種潛在的治療動脈粥樣硬化心血管疾病藥物。Charlton等[20]利用適配體結合中性粒細胞中彈性蛋白酶從而阻止其催化反應,其作用超過了此蛋白酶的天然抑制因子。而可識別凝血因子Ⅸa的RNA適配體在臨床中已可替代肝素,并可通過適配體的互補序列來調控抗凝效果[21]。最近人們開發出一些與腫瘤、艾滋病、肝炎相關蛋白質的適配體,可直接用于干擾疾病的發展過程[22]。原核生物中發現的Riboswitch更是適配體參與基因表達調控的一大里程碑,該發現提示不需要蛋白質因子的參與,RNA與代謝產物結合即可調控自身的轉錄和/或翻譯。根據這一原理,人工構建的Ribos-witch能夠實現目的基因的可調控表達[23],利用Ri-boswitch特性有可能開發出新型抗生素。
3適配體在動物醫學領域的應用前景
3.1動物疫病治療中的應用
適配體在治療動物疫病方面的研究還處在起始階段,近年來在病毒性疾病、細菌性疾病和寄生蟲病治療方面都有了初步探索結果。病毒性疾病方面,Cheng等[24]利用SELEX技術篩選出與H5N1亞型流感病毒HA1蛋白結合的DNA適配體,對H5N1亞型流感病毒具有抑制活性;Jang等[25]在體外篩選出抑制人嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS)NT-Pase/解旋酶的RNA適配體,通過抑制該病毒雙鏈DNA的解旋來抑制病毒復制。King等[26]以純化的朊病毒蛋白質作為靶物質,篩選到了適配體97,試驗證明該適配體在腦組織勻漿中能特異性地識別和結合朊病毒蛋白質。細菌性疾病方面,江麗等[27]篩選到了與葡萄球菌腸毒素B(ESB)特異、高親和力結合的單鏈DNA(ssDNA)適配體,為金黃色葡萄球菌感染的診治奠定了基礎;潘勤等[28]篩選出了針對傷寒桿菌IBV型纖毛操縱子的適配體,該適配體能顯著抑制傷寒桿菌侵入THP-1細胞。這些研究成果使得開發新型預防和控制動物傳染病感染的藥物成為可能。
此外,在寄生蟲病的防治方面,也有人進行了初步研究。非洲布氏錐蟲是人與家畜易感的致命的寄生蟲病的病原,目前所使用的藥物毒副作用大,且存在耐藥現象。Homann等[29]構建了85個核苷酸的RNA序列文庫,得到了3個家族的抗布氏錐蟲適配體。其中,適配體2-16能折疊形成假結發夾結構并能夠與血流階段的布氏錐蟲結合,親和力達到6·0×10-5mol/L。這不僅對寄生蟲病的治療方法進行了探索,還為適配體用于活組織或其他復合物表面成分的鑒定及定位提供了依據。
3.2動物產品檢驗中的應用
