時間：2022-07-04 19:43:12
序論：在您撰寫醫學實踐論文時，參考他人的優秀作品可以開闊視野，小編為您整理的7篇范文，希望這些建議能夠激發您的創作熱情，引導您走向新的創作高度。
實踐小組共24名同學又分為7個小組，在白鶴社區及其周邊的6個醫療衛生服務站點實習。每個小組3~4個組員，有一個小組長帶領，在一個站點實習2~3天后，換到另一站點，這樣依次輪轉，整個實習為期10天。6個服務點分別是白鶴醫院、丹頂鶴衛生服務站、丹鳳衛生服務站、孔雀衛生服務站、兒童保健科和防治保健科。
白鶴醫院實踐的同學主要在內科實習，他們為前來就診的患者提供最基本的服務，如量血壓等，同時做老師的助手，有時也做一些護理工作。星期一有個中暑病人昏倒后前來就診，我們的一位同學協助老師參與搶救，及時有效地替病人緩解癥狀，為老師進一步治療爭得時間。還有一些老年病人往往行動不便，同學們就會上前攙扶，領他們配藥，注射等。這些都得到了病人和家屬的稱贊，雖然比較辛苦，但我們無比自豪，因為這一點一滴都是為人民服務，是自身價值的體現，是無私愛心的奉獻。
在丹頂鶴衛生服務站實習的同學們為病人量血壓、測體溫，做一些基本的護理，為他們解答一些日常生活健康方面的問題等。通過實習，我們對醫生的角色有了更進一步的了解，醫生惟有具有技術、責任和愛心才能成為受患者愛戴和尊敬的好醫生，才能不辜負病人對醫生的期望，才能對得起病人把生命都托付給醫生的這種信任，才能對得起醫生這個稱號?？吹浆F在這么多病人受慢性病的折磨和一些不治之癥，我感到醫生們任重而道遠，而這就是我們將來的使命，是我們若干年后的神圣職責。社區醫生們和藹耐心的態度，細致認真的工作為我們樹立一個又一個的好榜樣，那天在丹頂鶴站，醫生聽到急忙前來的家屬說90多歲的老人躺在家很不舒服，他急忙拎起醫藥箱，頂著烈日出診，這些也為我們提供了一個活生生的醫德教育的課堂。丹鳳和孔雀衛生服務站也是為其鄰近居民解決常見健康問題，同學們在那邊也受益匪淺。
兒童保健科是專門面向兒童，為他們在成長過程中有效地預防各種易發病提供咨詢，保健服務，并為了保證兒童健康成長，在飲食，營養，睡眠，運動等各方面給予各種建議，指導家長科學地養育子女。我們在這里了解了兒?？漆t生的工作，他們細心地為每一名兒童建立成長檔案，定期為他們體檢，為家長仔細解釋在養育孩子過程中遇到的各種問題。
防治保健科是提供疫苗接種服務為主的站點，接種各種計劃內疫苗和自費疫苗，來接種的大都是一些兒童，防保科為每個兒童建立數字化資料，并及時通過各種方式通知家長帶領孩子前來接種。我們在防保科了解了各種疫苗種類、接種時間、接種次數，也幫助那里的老師整理接種記錄等資料，建立傳染病報告等檔案，是老師們的得力助手，得到老師們的一致贊揚。
一、醫學類大學生社會實踐與志愿服務工作的內容和模式分析
（一）醫學類大學生社會實踐與志愿服務工作的內容
社會實踐與志愿服務工作主要是根據學生所學醫學專業的特點，為醫院患者或者社區群眾開展衛生宣傳教育和衛生診療服務等，從而提高學生將自身的專業知識運用到實踐的能力，以便為社會和群眾提供更多的服務。社會實踐與志愿服務工作的內容主要為圍繞醫學知識宣講和醫療服務等方面開展。
（二）醫學類大學生社會實踐與志愿服務工作的模式
1.參觀教育模式。學校組織醫學生到一些大型的醫院中進行參觀，主要包括醫生的診治過程、手術過程等觀察，讓醫學生充分認識到醫療工作的重要性，切實提高廣大醫學生的敬業精神。
2.服務奉獻模式。組織廣大醫學生深入敬老院、福利院、孤兒院、兒童聾啞學校等社會福利組織中，為這些人群開展各項醫療和衛生服務工作，從而幫助他們切身感受到這些特殊人群生活的疾苦，不斷提高醫學生的道德素養。
3.專題調研模式。在導師的帶領下，將醫學生劃分成若干專題研究小組，主要進行對醫學的研討和社會調查活動等等，主要是為了培養廣大醫學生社會認知能力和科學研究能力[1]。4.其他模式。醫學類大學生開展社會實踐與志愿服務的模式還包括送藥、送醫以及送衛生知識下鄉等。
二、醫學類大學生社會實踐和志愿服務工作模式存在的問題
（一）社會實踐和志愿服務工作模式單一
當前醫學類大學生社會實踐和志愿服務工作模式相對單一，主要是以下兩個原因：一是個別學生參與社會實踐和志愿服務的積極性不高；二是個別醫學院還不能充分意識到社會實踐和志愿服務工作的重要性，并缺乏針對社會實踐和志愿服務考核體系，不能在醫學生中產生較大的教育意義。
（二）社會實踐和志愿服務脫離實際
從當前個別醫學院開展的社會實踐和志愿服務工作來看，很多都是根據教學課程安排的需要，缺乏將社會實踐和志愿服務跟實際有效結合起來。
（三）社會實踐和志愿服務專業性不強
個別醫學院的組織者在開展社會實踐和志愿服務過程中不能有效將活動內容跟學生的專業、社會熱點的話題充分結合起來。
三、提高醫學類大學生社會實踐和志愿服務區的效果的重要途徑
（一）加強社會實踐和志愿服務的宣傳工作
作為醫學院，要充分利用社會媒體加強對醫學生社會實踐和志愿服務的宣傳力度，從而幫助社會及時了解醫學生參與社會實踐和志愿服務的重要性，進一步為學生參與社會實踐和志愿服務創造良好的氛圍。另外，醫學院還應該充分利用自身的校園網、宣傳欄、廣播等宣傳在社會實踐和志愿服務表現突出的團體和個人，從而充分調動學生參與社會實踐和志愿服務的積極性和熱情。
（二）豐富社會實踐和志愿服務的模式
由于低年級的醫學生自身的專業知識有限，業余時間少，學校在組織這部分學生參與社會實踐和志愿服務時應該進一步創新社會實踐和志愿服務的模式，在充分整合社會和校園的各方資源的基礎上，為其創造一個相對穩定的醫學生實踐基地，并建立起具有醫學生社會實踐和志愿服務特色的創新機制，充分培養醫學生的組織、協調以及溝通能力[2]。
（三）加強社會實踐和志愿服務制度建設
組織廣大醫學類大學生參與社會實踐和志愿服務不但可以幫其深入基層、了解社會，還可以提高他們的專業知識。因此醫學院應該進一步加強醫學類大學生社會實踐和志愿服務工作的制度建設，爭取從動員——申報立項——時間團隊資料審批——實踐團長安全教育整個過程能夠得到有效的監督和指導，提高醫學生社會實踐和志愿服務工作的效果。
總結
ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells
【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.
【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis
【摘要】目的：表達具備生物活性的重組小鼠Wnt3a信號蛋白.方法：應用脂質體轉染試劑將重組真核表達載體pSecTag2/HygroBWnt3a轉染并篩選穩定表達的NIH3T3細胞，WesternBlot鑒定重組Wnt3a蛋白的表達，并對Wnt3a/NIH3T3細胞的融合密度及抗凋亡能力給予檢測.結果：Wnt3a信號蛋白在Wnt3a/NIH3T3細胞中獲得穩定表達，Wnt3a信號蛋白能夠明顯提高NIH3T3細胞的融合密度及抗凋亡能力.結論：在NIH3T3細胞中表達的重組Wnt3a信號蛋白具備生物活性.
【關鍵詞】Wnt3a；真核表達；接觸抑制；細胞凋亡
0引言
小鼠Wnt3a基因是Wnt基因家族中的重要成員，其編碼表達Wnt3a信號蛋白.Wnt3a信號蛋白可以激活經典的Wnt/βcatenin信號通路.Wnt3a信號蛋白對神經干細胞表現出明顯的促神經元分化的作用.我們應用基因重組的方法，從小鼠胚腦中克隆Wnt3acDNA，構建真核表達載體，通過陽離子脂質體試劑將目的基因導入NIH3T3細胞中，建立穩定表達Wnt3a信號蛋白的NIH3T3細胞株，并對其生物學活性進行初步分析.
1材料和方法
1.1材料真核表達載體pSecTag2/HygroBWnt3a由本研究室構建.NIH3T3細胞株由安徽醫科大學病理教研室吳強教授惠贈.多聚賴氨酸購自博士德公司；胎牛血清及DMEM購自Gibco公司.潮霉素及LipofectamineTM2000轉染試劑盒、購自Invitrogen公司.質粒小量提取試劑盒WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationsystem,ReverseTranscriptionSystemRTPCR試劑盒購自Promega公司；鼠抗mycmAb、鼠抗βcateninmAb購自SantaCruz公司，FITC標記的兔抗鼠二抗、TRITC標記的兔抗鼠二抗購自北京中山公司；臺盼藍購自sigma公司.其他試劑均為進口分裝或國產分析純.
1.2方法
1.2.1NIH3T3細胞的培養將凍存的NIH3T3細胞復蘇后用含100g/L的胎牛血清的DMEM培養液，在37℃50mL/LCO2培養箱中培養，3d換液1次,傳代3至4次使細胞達到良好的生長狀態.
1.2.2NIH3T3細胞的轉染按LipofectamineTM2000試劑說明書操作進行.轉染前24h用胰蛋白酶消化貼壁的NIH3T3細胞，再以無血清及無雙抗的DMEM培養基重懸，并按1×105的細胞密度接種于6孔培養板，培養24h后，當細胞生長至85%～90%融合度時，取純化的重組質粒pSecTag2/HygroBWnt3a2μg，溶于250μL無血清的DMEM培養基中，得到A液.取3μLLipofectamineTM2000加于97μL無血清的DMEM培養基中，得到B液.將A,B液混勻，室溫放置30min后加入0.8mL含100g/L胎牛血清的DMEM培養基，輕輕混勻，均勻滴加于經無血清培養基洗滌的貼壁細胞表面，于37℃50mL/LCO2培養箱中培養24h.棄去轉染液，加2mL完全培養液繼續培養.轉染后48h，待細胞生長至接近融合時收集上清，并按1∶3的密度傳代.繼續培養至細胞密度達50%～70%.棄去培養液，更換濃度為600mg/L的潮霉素培養液進行篩選.轉染時，設置轉染空載體pSecTag2/HygroB的組和正常細胞陰性對照組.約14d后，可見有陽性克隆形成，繼續擴增培養.穩定表達Wnt3a蛋白的細胞株命名為Wnt3a/NIH3T3（W/3T3），轉染空載體的細胞株命名為empty/NIH3T3（E/3T3），正常細胞陰性對照組命名為control/NIH3T3（C/3T3）.
1.2.3重組Wnt3a蛋白鑒定轉染48h后，分別收集C/3T3,E/3T3和W/3T3細胞各約1×106及其培養上清液.以SDS煮沸法裂解細胞并收集上清，并將其與細胞培養上清液真空冷凍干燥，濃縮至1/2體積，以鼠抗mycmAb為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法行重組Wnt3a蛋白的鑒定.
1.2.4βcatenin的表達鑒定分別在轉染后6,12,24h收集W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞各約1×106，以SDS煮沸法裂解細胞并收集上清，以鼠抗βcateninmAb為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，使用WesternBlot方法進行鑒定.
1.2.5Wnt3a/NIH3T3細胞增殖特性的鑒定以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞于24孔培養板，隔日觀察，臺盼藍染色并使用血細胞計數板計數活細胞.
1.2.6Wnt3a/NIH3T3細胞抗凋亡實驗以密度約1×105接種W/3T3,E/3T3及C/3T3細胞于24孔培養板，24h后臺盼藍染色并使用血細胞計數板計數活細胞數，同時更換含10g/L胎牛血清的DMEM培養液，定時觀察并臺盼藍染色并使用血細胞計數板計數活細胞，計算存活細胞與原始細胞數的比值.
統計學處理：用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析.
2結果
2.1重組Wnt3a蛋白在的NIH3T3細胞中獲得表達WesternBlot鑒定發現轉染Wnt3a基因的NIH3T3細胞裂解液中有一Mr約為45×103的特異性條帶，在轉染Wnt3a基因的NIH3T3細胞培養上清液、E/3T3及C/3T3細胞裂解液和細胞培養上清液中，均未發現相應條帶(圖1).
1:W/3T3組細胞裂解液；2：W/3T3組細胞培養上清液；3：E/3T3組細胞裂解液；4：C/3T3組細胞裂解液.
圖1WestemBlot鑒定Wnt3a信號蛋白的表達（略）
2.2Wnt3a/NIH3T3細胞中βcatenin的表達上調對Wnt信號通路中的重要信息分子βcatenin的表達情況進行WesternBlot鑒定，在Mr約90×103處出現特異性條帶(圖2)，但無時間依賴性.
1~3:培養6,12,24h.
圖2各實驗組βcatenin表達（略）
2.3Wnt3a/NIH3T3細胞融合密度明顯增高經臺盼藍染色計數活細胞，以密度約1×105接種的E/3T3及C/3T3細胞3d后生長至融合密度，此時細胞融合密度約4.6×105，但W/3T3細胞繼續生長至第6d，細胞融合密度約13×105，與另外兩組相比，W/3T3細胞融合密度明顯增高（P<0.01）(圖3，4).
A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.
圖3各實驗組細胞融合密度觀察(倒置×100)（略）
2.4W/3T3細胞抗凋亡能力明顯增高經臺盼藍染色計數活細胞，更換含10g/L胎牛血清的培養液48h后，E/3T3及C/3T3細胞大量凋亡，細胞數明顯減少，但W/3T3細胞數無明顯減少，抗凋亡能力明顯提高（P<0.01）(圖5，6).
圖4實驗組細胞數變化（略）
A：W/3T3；B：E/3T3；C：C/3T3.
圖5各實驗組細胞抗凋亡能力觀察(倒置×100)（略）
圖6實驗組存活細胞比例（略）
3討論
Wnt信號蛋白為含有23～24個保守型半胱氨酸殘基,在人類的基因組中已經發現Wnt基因19種［1-2］.Wnt3a是Wnt基因家族的重要成員，其基因早在1992年就已經被發現，而且多種的真核細胞被用于它的表達，但由于其低溶解度及疏水性等特點，一直未能純化出具備生物活性的Wnt3a信號蛋白.1998年，Shibamoto等［3］使用L細胞（鼠胸腺激酶缺陷細胞株；LMTK）作為表達細胞時，在培養上清中發現了大量具備生物活性的Wnt3a蛋白，約400μg/L.Willert等［4］所純化的Wnt3a信號蛋白通過激活Wnt信號通路促使骨髓中的造血干細胞分裂和自我復制，認為Wnt可能在一系列組織的自我更新中起信號作用.
βcatenin是經典的Wnt/βcatenin信號通路中重要的信息分子［5］，其在Wnt信號通路關閉的情況下，βcatenin被磷酸化而迅速降解.Wnt信號通路被激活后，βcatenin在胞內大量聚集，并進入細胞核，啟動下游靶基因的轉錄，產生生物學效應.βcatenin表達的明顯上調代表Wnt信號通路被激活.實驗中WesternBlot鑒定發現βcatenin表達明顯上調，但沒有發現與時間有依賴關系.實驗中表達的重組Wnt3a信號蛋白帶有myc標簽，Burrus等［6］認為如果Wnt3a信號蛋白帶有標簽將影響其活性，甚至失活.但同樣有文獻［7,8］中應用的Wnt3a信號蛋白帶有myc,HA等標簽，而且文獻中對其活性同樣做了詳細的描述.本實驗夠構建的重組Wnt3a信號蛋白具備生物學活性，但未能與野生型（wildtype）Wnt3a信號蛋白活性做詳細的比較，其生物學活性的變化有待進一步分析.
Wnt3a蛋白可以促進神經干細胞向神經元分化.在使用含有Wnt3a信號蛋白的條件培養液培養E11.5d的胎鼠前腦神經干細胞發現，神經干細胞大量分化成為MAP2陽性的神經元.去除Wnt3a信號蛋白后，神經干細胞恢復增殖能力，而且當條件培養液中的FGF2去除后，分化的神經元形態更為成熟［8-9］.來源于小鼠大腦皮質的神經干細胞轉基因后超表達Wnt信號蛋白，即使在培養液中加入FGF2，依然大量向神經元分化，但阻斷Wnt信號通路后神經元的分化被抑制［10］.
Wnt信號通路的生物學作用十分復雜，不同的Wnt基因，不同的細胞，甚至不同的細胞狀態都有可能產生不同的作用［11］.在本實驗中我們采用pSecTag2/HygroBWnt3a真核表達載體，NIH3T3細胞作為表達細胞，成功表達重組Wnt3a信號蛋白，初步探討了Wnt3a信號蛋白的生物學活性，為進一步建立用于以治療為目的的分子移植的方法奠定基礎.
【參考文獻】
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EffectsofoctylphenoloncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercells
【Abstract】AIM:Toobservetheeffectsofoctylphenol(OP)oncellcycleandcyclinexpressionofMDAMB231breastcancercellsandtoprobethemolecularmechanismsofOPinhibitingMDAMB231breastcancercellproliferation.METHODS:Thechangesofcellproliferation,cellcycle,cyclinD1mRNA,cyclinD3mRNA,CDK2mRNA,CDK4mRNAandcyclinD1proteinexpressionsofMDAMB231cellstreatedwithOPwereobservedbyusingMTTtest,flowcytometry,immunocytochemistryandRTPCR.RESULTS:WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith4or8μmol/LOPfor48h,thecellinhibitionrateswere(17.13±4.1)%,(40.25±8.7)%,andthefluorescencevaluesofcyclinD1were55.1±10.2,41.4±11.2,significantlydecreasedascomparedwithcontrolgroup(89.9±11.2,P<0.05).WhenMDAMB231breastcancercellsweretreatedwith8μmol/LOPfor24and72h,thecellratiosintheG0/G1phasewere(67.0±17.6)%and(44.4±11.9)%，significantlyincreasedascomparedwithcontrolgroup［(46.6±12.8)%at24h,(15.3±3.1)%at72h,P<0.05］.OPinhibitedthemRNAexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4andtheproteinexpressionofcyclinD1.CONCLUSION：OPcaninhibittheproliferationofMDAMB231breastcancercells,whichmayberelatedtodownregulatingtheexpressionsofcyclinD1,cyclinD3,CDK2andCDK4mRNAandcyclinD1protein.
【Keywords】cellproliferation;breastneoplasms;octylphenol;cyclinD1；cylindependentkinases
【摘要】目的:觀察辛基酚(OP)對細胞周期及周期蛋白表達的影響，探討OP抑制MDAMB231乳腺癌細胞增殖的可能分子機制.方法：以MTT試驗、流式細胞分析、免疫細胞化學和RTPCR等方法觀察OP對MDAMB231乳腺癌細胞增殖、細胞周期、CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3表達的影響.結果：4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞48h時，其抑制率為(17.1±4.1)%,(40.3±8.7)%，cyclinD1表達量熒光值為55.1±10.2，41.4±11.2，比對照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞24h和72h，G0/G1期細胞為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細胞比對照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).OP導致MDAMB231乳腺癌細胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA的表達降低，且cyclinD1蛋白的表達也降低.結論：OP能抑制MDAMB231乳腺癌細胞增殖，其機制可能與OP能降低乳腺癌細胞中CDK2，CDK4，cyclinD1和cyclinD3mRNA及其蛋白的表達有關.
【關鍵詞】細胞增殖;乳腺癌;辛基酚；細胞周期蛋白D1;細胞周期蛋白質依賴激酶類
0引言
辛基酚（octylphenols,OP）是一種環境雌激素，近年來對它的雌激素活性檢測及其生殖毒性效應研究較多［1］.OP能促進ERα+MCF7乳腺癌細胞的增殖，表現雌激素活性，卻抑制ERα-MDAMB231乳腺癌細胞的增殖［2］.細胞增殖與細胞周期密切相關，本研究將OP作用于MDAMB231乳腺癌細胞，觀察細胞的增殖和CDK2,CDK4,cyclinD1，cyclinD3表達的改變，探討OP影響MDAMB231乳腺癌細胞增殖的作用機制.
1材料和方法
1.1材料試劑中，OP純度>98%，sigma產品.cyclinD1抗體為兔抗人抗體，使用濃度為1∶75倍稀釋，FITC標記羊抗兔抗體，北京中杉產品.RTPCR試劑盒，上海sangon產品.二甲亞砜(DMSO)，純度>98%，進口分裝試劑，用于配制OP.MDAMB231乳腺癌細胞由中科院上海細胞所提供.實驗前將MDAMB231乳腺癌細胞在無酚紅的DMEM/F12中培養24h以耗盡細胞的內源性雌激素，然后以該培養基進行實驗.實驗分為3組：對照組，給予DMSO；4μmol/LOP組；8μmol/LOP組.
1.2方法
1.2.1MTT試驗以492nm波長測定活細胞的吸光度（A），抑制率（PR）=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%，每次試驗設2個平行孔，試驗重復3次［3］.
1.2.2細胞周期相及凋亡檢測實驗各組細胞處理24,48和72h，收獲細胞，700mL/L冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，每次試驗設2個平行孔，試驗重復3次.
1.2.3cyclinD1表達分析細胞生長于小蓋玻片上，多聚甲醛固定，血清封閉，加一抗于37℃孵育50min，加熒光素標記二抗孵育20min，甘油封片，LeicaNT激光共聚焦顯微鏡觀察、照相及數據分析，實驗重復2次.計算熒光強度時每組實驗取3張片子，每張片子取36個視野，每個視野取5個細胞，計算其平均熒光強度.
1.2.4RTPCR檢測CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3的mRNA表達實驗各組細胞處理24h，收獲細胞，用Trizol試劑一步法提取各組細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，置-80℃備用.引物由上海sangon合成，CDK2：F5′GCTCTCACTGGCATTCCTCCT3′，R5′5′CGAAATGAAGGCACTAGAGC3′，產物546bp；CDK4：F5′CTACCTCTCGATATGAGCCAGT3′，R5′CATCTGGTAGCTGTAGATTCTG3′，產物563bp；cyclinD1：F5′GAGGAACAGAAGTGCGAGGA3′，R5′TCTGGAGAGGAAGCGTGTGA3′，產物501bp；cyclinD3：F5′TGTCAGGAGCAGATCGAAGC3′，R5′CCTTTAGAAGGCACTAGAGC3′，產物453bp；βactin：F5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，R5′GGCGGCACCACCATGTACCCT3′，產物202bp.25μL體系加樣本總cDNA，上游和下游引物各1.5μL，依次加入試劑盒其他成分.反應條件為94℃滅活40s，60℃或61℃退火40s，72℃延伸40s，22個循環，20g/L瓊脂糖電泳，照相，半定量分析以凝膠成像系統的分析軟件Q1來分析其灰度值，每實驗重復3次，以目的條帶/βactin之比值為結果，各組間進行單因素方差分析.
統計學處理：數據用x±s表示，組間比較用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析.
2結果
2.1MDAMB231乳腺癌細胞增殖以4,8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞48h，細胞抑制率為(17.1±4.1)%，(40.3±8.7)%.
2.2MDAMB231乳腺癌細胞周期相分布8μmol/LOP作用MDAMB231乳腺癌細胞24h和72h，G0/G1期細胞分別為(67.0±17.6)%和(44.4±11.9)%，G0/G1期細胞比對照組［24h，(46.6±12.8)%；72h，(15.3±3.1)%］明顯增高(P<0.05).
2.3MDAMB231乳腺癌細胞中cyclinD1蛋白表達cyclinD1蛋白主要表達于細胞的胞漿中(圖1)，4,8μmol/LOP組cyclinD1表達量熒光值分別為55.1±10.2，41.4±11.2，比對照組(89.9±11.2)明顯降低(P<0.05).
A：對照組；B：4μmol/LOP組；C：μmol/LOP.
圖1OP對MDAMB231乳腺癌細胞中cyclinD1表達的影響SPFITC×400（略）
2.4MDAMB231乳腺癌細胞中CDK2,CDK4,cyclinD1,cyclinD3mRNA表達mRNA的表達以電泳條帶的亮度來判斷，亮度值越強，mRNA量越高，經凝膠成像系統軟件處理，與對照組比較，OP組CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA表達均降低(圖2).
M:marker;1:8μmol/LOP;2:4μmol/LOP;3:對照.aP<0.05vs對照.
圖2OP對MDAMB231乳腺癌細胞中cyclinD3,cyclinD1,CDK2,CDK4mRNA表達的影響（略）
3討論
雌激素是哺乳動物體內分泌的一種性激素，起著調節動物生長、分化和生殖的作用.OP是一種苯環類化合物，能與ERα結合，顯示出雌激素活性.OP主要用于生產非離子表面活性劑、增塑劑、熱穩定劑、光穩定劑等，廣泛存在于生活、工作環境的水體、淤泥、土壤和食物如魚類、貝類及飲用水中［4］.MDAMB231乳腺癌細胞是一株ERα-的細胞，>15μmol/LOP對MCF7乳腺癌細胞會產生毒性作用，1~10μmol/LOP會對MDAMB231乳腺癌細胞產生毒性效應，抑制MDAMB231乳腺癌細胞的增殖［1］.以植物雌激素三羥異黃酮作用184B5/HER細胞，結果發現活細胞數量減少，呈劑量效應關系，同時G0/G1期細胞增高，細胞凋亡也增多.本研究結果顯示4，8μmol/LOP均能抑制MDAMB231乳腺癌細胞增殖，并呈時間效應和劑量效應.
細胞增殖依賴于細胞周期的順利進行，該過程受G1/S，G2/M兩個關健點調控.植物雌激素三羥異黃酮能將MDAMB231乳腺癌細胞阻滯于G2/M期，細胞凋亡增加［5］，超二倍體增加.本研究結果顯示OP作用MDAMB231乳腺癌細胞24h，G0/G1期細胞(凋亡峰)明顯增加(P<0.05)，表明OP具有急性毒性作用，細胞迅速凋亡.OP引起MDAMB231乳腺癌細胞周期阻滯與三羥異黃酮不同，這可能與三羥異黃酮具有多種生物活性有關.
細胞增殖依賴于細胞周期的順利進行，細胞周期的正常進行又依賴于細胞周期調控蛋白如cyclinD，cyclinA，cyclinE等及細胞周期依賴性激酶(CDK)的正常表達.cyclinDCDK4是G0/G1期的限速步驟，過度表達G1期的周期蛋白如cyclinD，cyclinE能加速細胞快速通過G1期.cyclinD1蛋白表達與細胞周期運行有關［6］，抑制腫瘤組織生長與P53的高表達及cyclinD1低表達相關［7］.以17羥雌二醇作用雌性Wistar大鼠60d，發現雌二醇通過減少CDK2，CDK4的表達以及降低CDK2活性，將細胞阻滯于G1/S期［8］.本研究結果表明，OP作用MDAMB231乳腺癌細胞后，能降低CDK2,CDK4,cyclinD1及cyclinD3mRNA的表達，降低cyclinD1蛋白的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖，細胞阻滯于G1/S期，導致MDAMB231乳腺癌細胞的增殖受抑，并呈劑量效應和時間效應.
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ExpressionofMMP9inskinsquamouscellcarcinomaanditssignificanceinmicroangiogenesis
【Abstract】AIM:TodetecttheroleandthesignificanceofMMP9inmicroangiogenesisinskinsquamouscellcarcinoma(SCC)andtoobservetherelationbetweentheexpressionofMMP9andmicrovesseldensity(MVD)inSCC.METHODS：ImmunohistochemicalSPstainingwasusedtoexamineMMP9expressionandthechangeofMVDunderlightmicroscopein45casesofSCC,19casesofBowendisease,and10casesofnormalskin.RESULTS：TheexpressionofMMP9inSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,whilethelatterwasalsosignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P=0.028，P<0.05）.ThelevelofMVDinSCCgroupwassignificantlyhigherthanthatinBowendiseasegroup（P<0.05）,andthelatterwassignificantlyhigherthanthatinnormalskingroup（P<0.05）.CONCLUSION：MMP9ishighlyexpressedinSCC,andmaybeoneofimportantfactorsinangiogenesisofSCC.
【Keywords】skinneoplasms;carcinoma,squamouscellimmunohistochemistry;gelatinaseB;antigens,CD34;microvesseldensity
【摘要】目的：探討皮膚鱗狀細胞癌（SCC）發生發展過程中基質金屬蛋白酶9（MMP9）對微血管生成的意義.方法：SCC45例,Bowen病19例、正常皮膚10例進行CD34,MMP9免疫組化染色.檢測MMP9的表達和微血管密度（MVD）的變化，分析MMP9的表達與MVD之間，及它們與SCC臨床病理特征之間的關系.結果：在SCC組中MMP9表達高于Bowen病組（P<0.05）,Bowen病組中MMP9表達高于正常皮膚組（P=0.028,P<0.05）.在SCC組中MVD值高于Bowen病組(P<0.05)，Bowen病組中MVD值高于正常皮膚組（P<0.05）.結論：MMP9可能是SCC促進微血管生成因子之一，與SCC的侵襲性相關.
【關鍵詞】皮膚腫瘤；免疫組織化學；明膠酶B；抗原CD34；微血管密度
0引言
癌細胞侵襲和轉移能力與其誘導產生蛋白酶降解細胞外基質（ECM），基底膜（BM）的能力密切相關.基質金屬蛋白酶（MMP）是其中最為重要的一組蛋白酶，研究表明［1-2］，MMP對腫瘤的侵襲和轉移起重要的作用.Guttman等［1］研究表明MMPs在腫瘤血管生成中也有重要作用.明膠酶是MMPs的一個亞類，包括基質金屬蛋白酶2（MMP2）和基質金屬蛋白酶9（MMP9），近年MMP9與腫瘤血管生成的關系逐漸被重視.MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關鍵酶，而且在腫瘤間質血管生成中起重要作用.在皮膚鱗癌中，有關MMP9的研究報道很少，其結果也不完全一致.我們通過免疫組織化學技術檢測Bowen病(BD)，鱗狀細胞癌（squamouscellcarcinoma,SCC）組織中MMP9和CD34的表達，并對MMP9的表達與微血管密度（MVD）做定量分析，探討皮膚鱗狀細胞癌、Bowen病、基底細胞癌組織中MMP9對血管生成的作用及其臨床意義.
1材料和方法
1.1材料石蠟包埋組織標本選自西安交通大學第二附屬醫院199901/200605病理確診手術患者.SCC45例，年齡45～95(平均68.8)歲，男27例，女18例.Bowen病19例，年齡45～87(平均65.2)歲，男12例，女7例.正常人皮膚10例對照，年齡46～78（平均62.5）歲，男5例，女5例作鼠抗人MMP9mAb（MAB0245）和CD34mAb（(MAB0034)，免疫組化SP試劑盒(KIT9710)及DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司.
1.2方法所有組織均經40g/L甲醛液固定，常規石蠟包埋切片，連續切片5張，厚約4μm.采用SP法，免疫組化染色程序按試劑盒說明書進行.陽性對照采用自身對照,用PBS代替一抗和二抗進行陰性對照.MMP9和CD34均采用高溫高壓抗原修復.MMP9結果判定：在不知任何背景資料的情形下,采用雙盲法進行判定,以腫瘤細胞膜和/或細胞質出現淡棕黃色顆粒為陽性，并按著色強弱分級：無色為0，淺黃色為1，深黃色為2，棕黃色為3；著色范圍以在10×40高倍鏡下隨機選區5個視野（每個視野記數100個細胞）計數陽性細胞所占的百分數均值：＜25%為1,25%~49%為2，50%為3.上述兩項相加為MMP9的表達強度積分：＜2為陰性，＜3為弱陽性（+），3~4為陽性（），＞4為強陽性（）.MVD計數參照文獻［3-4］方法進行微血管計數，先在低倍鏡（×100）下觀察確定血管密度最高處，在（×200）視野下選擇3個高血管密度區，計算單位視野（×200）平均血管數.單個內皮細胞或內皮細胞簇，均作為一個血管計數，而直徑大于約8個紅細胞的血管，有較厚肌層的血管以及硬化區的血管不在計數范圍內.
統計學處理:采用SPSS10.0統計軟件包進行處理,根據資料類型組間比較分別采用方差分析和χ2檢驗，P<0.05為有統計學意義.
2結果
2.1MMP9MMP9陽性改變為細胞質或細胞膜呈棕黃色，偶爾可見細胞核著色，陽性顆粒多呈團塊狀.正常人皮膚組織中MMP9呈弱陽性表達，主要表達于顆粒層和棘細胞層，真皮層中纖維樣細胞、單一核細胞等見陽性染色.BD組織中表皮全層均有MMP9均勻彌漫表達.SCC中MMP9在癌巢組織彌漫分布，以腫瘤周邊表達強烈（圖1）MMP9表達在正常皮膚組、Bowen病組、SCC組依次增高（表1）.MMP9在SCC組中高于Bowen病組織（χ2=6.667,P<0.05），Bowen病組中MMP9高于正常皮膚組（P=0.028，P<0.05）.在SCC組中MMP9的表達與患者的年齡、性別、腫瘤組織的病理分級均無關（P＞0.05）.
表1MMP9在正常皮膚組、Bowen病組和SCC表達(略)
2.2MVD計數CD34標記的微血管呈點狀分布，血管內皮細胞膜被染成褐色.在SCC組織中微血管形態不規則，部分血管呈現發芽狀，血管分布不均勻，在SCC的邊緣區域最為密集，呈簇狀(圖2).Bowen病組織中微血管形態較規則，但分布不均，血管簇偶見.正常皮膚組織內的微血管形態規則，分布均勻.Bowen病組中和SCC組中MVD明顯升高（表3）.
圖1SCC組織MMP9表達SP×400(略)
表2SCC組織MMP9表達與患者年齡、性別及鱗癌分期的關系(略)
圖2SCC組織MVD計數SP×100(略)
表3CD34和MVD在Bowen病和SCC中表達(略)
aP<0.05vs正常皮膚.
3討論
本研究結果顯示,MMP9在SCC組中高于Bowen病組織（P<0.05），Bowen病組中MMP9高于正常皮膚組（P<0.05）.Bowen病MMP9在增生表皮細胞質或細胞核表達；在SCC組織中MMP9在腫瘤細胞，增生上皮細胞和間質細胞均有陽性表達，在表達的強度、陽性細胞的種類、數量上均高于Bowen病組，提示MMP9高表達可能是SCC轉移、侵襲能力的分子基礎.同時觀察到僅有部分有腫瘤細胞能表達MMP9，且表達MMP9的腫瘤細胞多位于癌巢的外周部分和毛細血管、淋巴管管腔周圍，提示MMP9表達的腫瘤細胞可能具有更強的侵襲能力.實體腫瘤的新生血管提供了更多與體循環連接的通路，這使腫瘤細胞更容易從原發灶向遠隔部位轉移.腫瘤組織中微血管密度越大，腫瘤細胞進入血循環及淋巴循環的機會越多，淋巴結及鄰近臟器轉移的機會也增大.在許多腫瘤中都發現：微血管密度與腫瘤侵襲性與腫瘤轉移的發生率相關［1,5-6］.近來研究表明，MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關鍵酶，而且在腫瘤間質血管生成中起重要作用［1，5］.Wang等［7］人的研究表明,存在于細胞外基質的VEGF能夠通過存在于血管平滑肌細胞上的VEGFR1受體調節MMPs的表達.而MMPs又能降解細胞外基質釋放更多的VEGF,這便建立了一個正反饋調節環路來促進新生血管的形成.Naglich等［8］研究發現MMP1,MMP2,MMP9誘發和促進血管生成，TIMP1,TIMP2,TIMP3,TIMP4抑制新血管生成.
本實驗顯示，在SCC組織中微血管形態不規則，血管分布不均勻，在SCC的邊緣區域最為密集，呈簇狀.Bowen病組織中微血管形態較規則，但分布不均.正常皮膚組織內的微血管形態規則，分布均勻.SCC組中MVD高于Bowen病組織（P<0.05），Bowen病組中MVD高于正常皮膚組（P<0.05），提示細胞在發生惡性轉化之前已有血管生成增多，這很可能是SCC血管生成的啟動階段.我們發現在SCC組、Bowen病和正常皮膚組中MMP9表達高者MVD表達亦高，且MMP9的高表達的部位與MVD高密度區具有一致性，均位于癌巢邊緣地區，提示：腫瘤的浸潤生長與新生血管生成是同步進行的，MMP9的表達與腫瘤血管形成有關.本研究結果表明，SCC的發生和侵襲轉移與腫瘤細胞的分化程度及新生血管的密度密切相關，MMP9可能是SCC的重要促血管生成因子之一.阻斷MMP9的表達，抑制MMP9的活化可能對抑制SCC轉移具有重要意義.
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EffectofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsincolorectalcarcinomaonHIF1αproteinlevel
【Abstract】AIM:TodetectmRNAexpressionsofVHLandFIH1incolorectalcancer,andexploretheireffectonHIF1αproteinlevel.METHODS:SemiquantitativeRTPCRassaywasusedtodetecttheexpressionsofVHLmRNA,FIH1mRNAin42patientswithcolorectalcancer;ExpressionofHIF1αproteinwasmeasuredbySPimmunohistochemistry;Spearmanrankcorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenthem.RESULTS:mRNAlevelsofVHLandFIH1incolorectalcancerweresignificantlylowerthanthoseinadjacenttissue（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；BothexpressionsdecreasedasDukesstageincreased,andtheexpressionsinDukesA+BstageweresignificantlyhigherthanthoseinDukesC+Dstage（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；Theirexpressionshadnorelationshipwithtumorlocationandgender.In42casesofcolorectalcancer,positiverateofHIF1αproteinwas69.1%(29/42),theexpressioninDukesC+Dstage(80.0%,24/30)wassignificantlyhigherthanthatinDukesA+Bstage(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02);itwasnegativeinadjacenttissue;SpearmanrankcorrelationdisplayedthattheexpressionsofVHLmRNAandFIH1mRNAwerenegativelycorrelatedwiththeHIF1αproteinlevel(rs=-0.97,P=0.01;rs=-0.66,P=0.01).CONCLUSION:TheoverexpressionofHIF1αmayplayanimportantroleinthedevelopmentandmatastasisofcolorectalcancer；ThedecreaseofVHLmRNAandFIH1mRNAexpressionsiscloselycorrelatedwiththeincreaseofHIF1αproteinlevelincolorectalcancer.
【Keywords】colorectalneoplasms;HIF1α;VHL;FIH1
【摘要】目的：檢測大腸癌中VHLmRNA，FIH1mRNA以及HIF1α蛋白的表達,探討VHL，FIH1對HIF1α蛋白水平的影響.方法：采用RTPCR技術檢測42例大腸癌組織和相應的癌旁正常粘膜組織中VHLmRNA，FIH1mRNA的表達，采用免疫組化SP法檢測HIF1α蛋白在大腸癌和癌旁正常組織中的表達，Spearman相關關系檢驗分析其之間的相關性.結果：大腸癌組織VHLmRNA和FIH1mRNA的表達水平顯著低于癌旁正常組織（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；二者的表達水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；它們的表達水平與與腫瘤部位、性別無關.大腸癌組織HIF1α蛋白表達陽性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；DukesC+D期(80.0%,24/30)顯著高于DukesA+B期(41.7%,5/12),(t=5.89,P=0.02)；Spearman相關分析顯示，HIF1α表達水平與VHLmRNA，FIH1mRNA的表達水平顯著負相關（rs=-0.97,P=0.01，rs=-0.66,P=0.01）.結論：HIF1α的過表達在大腸癌的發生發展、浸潤轉移過程中起著重要作用，大腸癌組織中VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關.
【關鍵詞】結直腸腫瘤；低氧誘導因子1α；VHL基因；缺氧誘導因子抑制因子1
低氧誘導因子1（hypoxiainduciblefactor1，HIF1）在低氧狀態下通過對靶基因的轉錄激活，調控著血管發生、紅細胞生成以及糖酵解等過程［1］.希佩爾林道病(vonHippelLindau,VHL)希佩爾林道病腫瘤抑制蛋白(proteinvonHippelLindau,pVHL)在依賴于氧的條件下作用于HIF1的α亞單位，促使其發生泛素化和蛋白酶體的降解［2］.低氧誘導因子1抑制因子(factorinhibitingHIF1,FIH1)能結合HIF1α并抑制其轉錄激活功能［3］.我們采用RTPCR法檢測了大腸癌組織和相應癌旁正常組織中VHLmRNA,FIH1mRNA的表達水平，同時采用免疫組化方法檢測HIF1α蛋白的表達，并進一步分析探討它們之間的相關性.
1材料和方法
1．1材料甘肅省人民醫院肛腸科200410/200504手術切除并經病理證實的新鮮大腸腺癌標本42(男27，女15)例，年齡31～76（中位56)歲.其中結腸癌7例，直腸癌35例.DukesA期5例，B期7例，C期18例，D期12例(有7例發生轉移),術前未做化放療.同時距腫瘤邊緣5～10cm以上切取正常組織作為自身對照.標本離體后5min內即投入液氮罐并轉至-80℃冰箱凍存.RNA提取試劑,飽和酚,100bpDNAladder購自上海生工;逆轉錄酶MMLV(RNaseH)，Taq酶，AgaroseGel，MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)，RNA酶抑制劑，瓊脂糖（Agarose）均購自大連寶生物公司;兔抗人HIF1α多克隆抗體購自武漢博士德公司;生物素鏈霉素抗生物素蛋白檢測系統(SP)試劑盒均購自福州邁新公司;根據從NCBI的Nucleotide數據庫中所查到VHL和FIH1mRNA序列，經計算機輔助設計引物，內參對照選用磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh).引物均由上海生工合成，使用濃度均50μmol/L(表1).
1．2方法
1．2.1VHL及FIH1的RTPCR檢測從-80℃冰箱中取出凍存的新鮮組織(癌及癌旁正常組織)200mg，采用Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA濃度及純度.使用Takara的MMLVRtasecDNAsynthesisKit(codeD6130)反轉錄合成cDNA的第1鏈，接著合成第2鏈（均照說明書操作）.將所得30μL產物凍存于-20℃以備進行PCR.PCR反應體系50μL，包括10×Buffer5μL,25mmoldNTPmixture0.5μL,TaqDNA酶1μL，目的引物（VHL或FIH1）上下游各1μL，Gapdh引物上下游各1μL，cDNA模板1μL，無菌水38.5μL.反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s,退火30s(退火溫度VHL55℃,FIH158℃)，72℃延伸45s，30個循環；72℃10min后終止反應.PCR產物于20g/L的瓊脂糖凝膠做電泳,以無菌水代替cDNA模板的PCR管為陰性對照，天能凝膠成像系統對電泳條帶拍照并進行半定量分析.VHLmRNA,FIHmRNA相對表達量以同一反應體系中目的產物電泳條帶密度指數與內參對照Gapdh電泳條帶密度指數的比值來表示.
1.2.2HIF1α免疫組化染色取出凍存的新鮮標本迅速置于40g/L甲醛中固定，制成石蠟塊.先行HE染色確定,取標本無出血、壞死區域,組織厚度5μm連續切片,HIF1α稀釋度1∶50,SP法染色，用PBS液代替一抗作陰性對照.DAB作底物顯色,蘇木素復染核,梯度酒精脫水,二甲苯透明,樹脂膠封片,顯微鏡下觀察.HIF1α判斷標準按文獻［4］:陽性細胞胞核呈棕黃色顆粒著色,陰性(-)為腫瘤組織完全不著色或陽性細胞數<5%；陽性(+)為腫瘤組織陽性細胞數的范圍為5%～25%；陽性()為腫瘤組織陽性細胞數的范圍為>25%～50%；陽性()為腫瘤組織陽性細胞數>50%.
統計學處理:數據采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗.計數資料兩組率的比較采用四格表的校正卡方檢驗，RTPCR結果和免疫組化結果的相關性采用Spearman等級相關分析，按α=0.05的水準判斷是否具有統計學意義.
2結果
2．1RTPCRVHLmRNA在大腸癌組織中的表達水平為0.51±0.08，癌旁正常組織中的表達水平為0.63±0.11，配對t檢驗結果顯示差異有顯著性（t=-10.14,P=0.00）；FIH1mRNA在大腸癌組織中的表達水平為0.52±0.05，癌旁正常組織中的表達水平為0.60±0.14，配對t檢驗結果顯示差異有顯著性（t=-15.26,P=0.00）.VHLmRNA，FIH1mRNA表達水平與發病部位，性別，Dukes分期以及有無轉移等臨床病理資料之間有關(圖1,2,表2).表2大腸癌組織VHLmRNA與FIH1mRNA的表達與臨床病理的關系
2．2免疫組化染色癌旁正常組織HIF1α免疫組化染色均為陰性（圖3）；癌組織中29例（69.1%）HIF1α陽性(圖4)，其中(+)16例，()10例，()3例.HIF1α表達與Dukes分期明顯相關，DukesA+B期和DukesC+D期的陽性率分別為41.7%(5/12),80.0%(24/30),兩者差異具有顯著性(P<0.05).無轉移者HIF1α陽性率為65.7%(23/35),有轉移者陽性率為85.7%(6/7),兩者差異無統計學意義.
2．3VHLmRNA，FIH1mRNA表達與HIF1α蛋白水平的關系我們采用非參數檢驗的Spearman等級相關分析，結果顯示，大腸癌組織中HIF1α表達水平與VHLmRNA和FIH1mRNA的表達水平呈顯著負相關(rs=-0.97,P<0.01；rs=-0.66,P<0.01).圖3癌旁正常組織HIF1α的表達SP×400
3討論
HIF1是一個異二聚體，由對氧敏感的α亞單位(HIF1α或HIF2α)和組成性表達的β亞單位(HIF1β,也稱之為芳香烴受體核轉位分子，ARNT)構成［5］.HIF1調節通路的失調對于癌癥以及缺血性疾病的發生發展有著重要的影響作用［6］.VHL基因定位于染色體3p2526區域,包含3個外顯子，編碼由284個氨基酸殘基組成的pVHL［7］.FHI1基因定位于染色體10q24，它在生物工程信息數據庫國家中心的基因座ID為55662.此基因有8個外顯子，全長14kb，可以編碼一種特異性的天冬酰胺羥化酶，屬于2酮戊二酸依賴性雙加氧酶家族［8］.我們用RTPCR法檢測了大腸癌和癌旁正常組織中VHLmRNA和FIH1mRNA的水平，同時用免疫組化法檢測了HIF1α蛋白在癌組織和癌旁正常組織中的表達.結果表明，VHLmRNA和FIH1mRNA在癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織；二者的表達水平隨Dukes分期而降低，DukesA+B期顯著高于DukesC+D期；FIH1mRNA在有轉移的病例中顯著低于無轉移的病例；它們的表達水平與與腫瘤部位、性別無關.而HIF1α蛋白表達在癌組織中總陽性率為69.1%(29/42),在癌旁正常組織中均為陰性；在DukesC+D期顯著高于DukesA+B期；HIF1α蛋白的表達在轉移的病例中高達85.7%(6/7)，而未轉移者為68.6%(23/35)，但卻無統計學意義，可能是樣本量過少的緣故.
Spearman等級相關分析顯示，HIF1α表達水平與VHLmRNA，FIH1mRNA的表達水平顯著負相關，這表明大腸癌組織中抑癌基因VHL以及FIH1的水平下降與HIF1α蛋白水平的升高之間存在密切相關.HIF1α的過表達在大腸癌的發生發展，浸潤轉移過程中起著重要作用，HIF1α高表達的癌組織具有較強的浸潤和轉移能力.提示HIF1α的表達可反映結直腸癌的生物學行為，可以作為判斷結直腸癌浸潤、轉移和預后的有價值指標.此外，低氧適應性反應在腫瘤發生發展中起著重要作用，而HIF1α是此過程中的樞紐環節，利用反義核酸抑制HIF1α的轉錄活性已經成為治療腫瘤的一個重要切入點［9-11］，隨著對VHL和FIH1作為HIF1α負性調節子功能的逐步闡明［12］，進一步探討聯合應用VHL基因治療和FIH1的擬似物，以降低HIF1α的表達和轉錄活性，抑制癌細胞的低氧適應反應，在防治大腸癌的發生發展，浸潤轉移方面將會有更廣闊的前景.
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1．1教學方式的改革
在教學方式上，突破“學校本位、課堂本位、教師本位”的模式。將單純的“教師講、學生聽”的注入式教學轉變為“學為主、教為導”的方式，在講解基本知識的基礎上，開展討論式、啟發式、總結式的上課形式，達到教與學的互動，使學生在主動、雙向、探索的過程中得到發展，從而提高學生的創新能力。如在臨床檢驗基礎實驗課中，在血常規檢驗中，要求學生自己制作血涂片，并且分析結果，每組學生分別對自己的實驗結果進行討論，按照復檢規則進行復檢，最終將結果報告出來，提高學生的動手及分析結果的能力，為臨床實習打下基礎。
1．2教學手段的改革
改革教學手段，充分利用文學、聲像、電子和多媒體等技術開展日常教學工作，增加學生獲取知識的現代化手段，調動學生學習的積極性，培養學生主動發現問題、解決問題的能力。同時利用網絡資源(校園網和互聯網等)，開展網絡課程教學。在臨床分子生物學檢驗的實驗課教學中，要求學生在網絡上進行基因查找，及相關論文的搜索，讓學生學會利用互聯網巨大的知識平臺，完成對知識的獲取，并且取得了一定的效果。
1．3鼓勵學生參與科研活動，培養學生的創新能力
鼓勵教師在教學過程中向學生介紹與教學相關內容的前沿進展，開拓學生的視野，激發學生的學習興趣;讓學生參與教師的科研工作，拓寬知識面，歷練實驗操作技能，以科研帶動實驗技能培養，促進學生的創新能力培養和科研能力的提高;鼓勵學生積極申請“大學生創新基金”課題，定期舉行科研知識講座，提高學生的科研素質的同時，也鍛煉了學生的實踐能力。
2實踐教學環節的改革
2．1加強學生動手能力的培養
除了與理論課同步的實驗課之外，增加綜合能力訓練與考核、技能訓練與考核，如定期組織臨床檢驗技能大賽，使學生掌握崗位必需的實際操作技能;同時除了最后一年的臨床實習外，在學習專業課時，還設置了周末去附屬醫院檢驗科實習的機會，以及增加了一門30學時的見習課，使學生具備常用儀器使用的技能和熟練使用臨床檢驗儀器設備，達到能上崗實習的目的。
2．2加強實驗教師的培訓力度，提高實驗教學人員的技術水平
培養“三高一強(學歷高、職稱高、綜合素質高、實踐教學能力強)”，一專多能的“創新性應用型”教師隊伍。積極拓寬進修渠道，為青年教師創造參加國內學術交流，外出參觀學習的機會。實行青年教師導師制，發揮名師傳、幫、帶作用。并要求青年教師每學期完成學習性聽課不少于40學時，不斷提高青年教師業務水平和綜合素質。鼓勵教師和實驗技術人員開設創新性實驗，切實提高自身技術水平，促進實驗室建設和教學質量的不斷提高。
2．3健全實踐教學管理監督體系
健全實踐教學質量管理監督體系，建立起規范的實踐教學管理模式和機制。本著“既重視目標管理，又重視過程管理”的思路，結合評估指標體系和學校的實際情況及人才社會需求調研和畢業生質量跟蹤調查的結果，修訂和規范實踐教學管理文件，加強實踐教學常規管理。將教學檢查與評估列為實踐教學管理的日常工作，進一步完善建立切實有效教學質量保證和監控體系、進一步加大學生評教、教師評學的參與力度。建立教師教學工作目標管理體系，制定考核標準，按標準做到定量與定性考核相結合，提高考核結果的科學性，嚴格按照標準做到定期考核與實時考核相結合，提高考核結果的有效性與科學性，進一步提高學生的實踐水平。
3改革的成效
