血液分析儀溯源校準和質量控制研究

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血液分析儀在臨床中有著非常廣泛的應用，其檢測結果的準確性直接影響臨床醫生對疾病的臨床診斷和治療。隨著儀器技術的進步，血液分析儀變得越來越復雜，全血計數中的定量參數越來越多。近年正從單機檢測轉向流水線檢測，血液分析流水線由血液分析儀、推片染色機、糖化血紅蛋白血液儀、蛋白分析儀等檢測模塊通過軌道連接組成，可使用一管血、一次上機即可得到多個檢測的結果。為臨床檢驗人員提供了高效快捷的工作流程，縮短了患者等候檢驗報告的時間，極大地提高了臨床檢測效率。同時，檢測項目不再局限于血常規檢測，新增了HbA1c、CRP和SAA等聯合檢測功能，這也對檢測結果的溯源校準提出了新的需求。邁瑞作為國內最大的血液分析儀制造商，建立了完善的血液分析溯源體系，以保證用戶端臨床檢測結果的準確可靠。血液分析儀的溯源標準化工作主要由ICSH（國際血液學標準化委員會）來推動，目前國際上已經發布了多個參考方法，衛生部已將這些參考方法轉化為行業標準指導檢測結果標準化的實施。但參考方法運行需要專門的儀器設備，并且速度慢、操作復雜，對人員操作要求高，如果由臨床實驗室執行，費時費力。國內外的法規都已明確要求制造商提供有溯源性的校準品。本文詳細介紹了邁瑞血液分析儀溯源校準和質量控制的實施過程，內部溯源傳遞始于制造商產品校準品的值，止于所使用的計量上最高參考標準，通過不間斷地比較鏈溯源至目前最高級計量級別的參考級別的參考方法或參考物質[1]。

1最高參考標準

1.1參考方法和參考實驗室的建立

目前已建有WBC、RBC、HGB、HCT（MCV）、PLT、RET計數和白細胞分類7個參考方法，參考方法執行過程中對儀器設備、試劑、人員、環境等均有嚴格要求。通用要求：環境要求18～25℃，人員經過培訓，考核合格后才能上崗操作。配制試劑均滿足臨床實驗室I級用水；樣本稀釋使用硅硼玻璃的A級容量瓶；因血液有一定黏度，所有參考方法加樣使用正向置換式移液器，減少黏度的影響，準確度為±0.5%，等等。紅細胞和白細胞參考方法：采用ICSH1994年發布的參考方法，使用單通道阻抗原理的半自動粒子計數器，通過梯度稀釋血液樣本，對結果進行重疊校準。使用的庫爾特粒子計數器小孔直徑為80～100μm，樣本檢測體積準確度小于1%，溫度對體積的影響每攝氏度小于0.1%；每個樣本梯度稀釋4個水平，重復配制2次，對8個結果進行直線回歸分析，回歸直線與Y軸的交點，代表樣本無限稀釋后，細胞可以一個一個通過小孔被檢測，即代表重疊校準的計數值。例如，梯度稀釋的重疊校準后，紅細胞參考方法結果為4.77，如圖1所示。血紅蛋白參考方法：采用了CLSIH15-A2發布的參考方法，使用氰化高鐵血紅蛋白法，在雙光束的分光光度計上進行檢測。分光光度計狹縫寬度小于等于2nm；配對石英比色杯，內徑為（1.000±0.002）cm。樣本重復稀釋2次，紅細胞溶解后，使用0.20～0.25μm的薄膜過濾器進行過濾，排除氣泡雜質等影響。檢測504nm、540nm、750nm波長下的吸光度。檢查氰化高鐵血紅蛋白溶液純度1.59≤A540nm/A504nm≤1.63，濁度A750nm≤0.003。計算540nm下血紅蛋白的濃度。紅細胞壓積參考方法：采用了CLSIH7-A3發布的參考方法，使用微量壓積離心機離心血樣后，在顯微鏡下使用游標卡尺讀取紅細胞柱和全血柱的長度進行計算，本方法未修正殘留血漿的影響。微量壓積離心機半徑大于8.0cm，離心5min轉子溫度不超過45℃。毛細胞符合美國材料實驗協會的要求。血小板參考方法：采用了ICSH2001年發布的流式細胞儀法和WHO人工相差顯微鏡鏡檢法2個方法互相比對。流式細胞儀法準確性高，但有受抗體質量影響的風險；鏡檢法準確性差，但穩定不受其他因素影響。使用CD41和CD61兩個抗體染料，檢測信號不少于5000個，得到紅細胞與血小板的比值，再乘以紅細胞參考方法的值，間接計算血小板值。網織紅細胞和白細胞分類參考方法：分別采用ICSH1998年發布的新亞甲藍法和CLSIH20-A中的人工鏡檢法。這2個方法對于血涂片的制備以及鏡檢人員的能力均有很高要求，所有的鏡檢人員均經過長期的專業培訓，考核合格后方上崗。參考實驗室：為確保檢測結果準確可靠，參考方法必須由參考實驗室執行。邁瑞參考實驗室按照ISO17025和ISO15195的要求[2-3]，建立了完善的質量管理體系，并在2009年通過了中國合格評定國家認可委員會（CNAS）認可，保證了實驗室參考測量技術能力的保持與提升。

1.2參考物質

可溯源至參考物質的項目包括HbA1c、CRP和SAA等?；Q性是參考物質的重要屬性。當參考物質用于制造商溯源程序為產品校準品定值時，首先必須驗證是否具有互換性[4]。如果產品校準品溯源至沒有互換性的參考物質，將導致不同常規程序測量病人樣本沒有可比性。當驗證時發現沒有互換性，但已被證明在其他多個測量程序中是有互換性，可修正沒有互換性的偏差，并記錄使用和驗證的詳細過程[1]。修正方案參考IFCC互換性工作組推薦的技術指南，包括開發和應用沒有互換性偏差的特定修正因子和函數及其不確定度，以及在校準層級中應用修正步驟的位置，實現臨床結果到參考物質的可追溯性[5]。

2溯源傳遞至產品校準品的過程

2.1溯源傳遞及產品校準品定值

針對每個項目都詳細定義溯源層級，并繪制溯源鏈。為減少測量不確定度，溯源過程應盡量減少中間傳遞過程，盡可能直接溯源至參考測量程序或參考物質。例如WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、PLT等項目均使用參考方法測試新鮮血，直接校準血液分析儀標準測量程序，然后給產品校準品定值。但如果參考測量程序或參考物質有限，可以增加適當的工作校準品。但在沒有合適的參考測量程序或參考物質時，會建立內部標準，這種情況通常是新發現的分析物或是參考基準建立困難的情況。但是無論是哪種情況下，都會確保臨床結果有適合的溯源校準水平。此外，溯源傳遞設計的過程中也必須結合產品需要考慮被測量是否相同。例如CRP項目溯源，使用的參考物質ERM474是血清中的CRP質量濃度值，而流水線直接檢測的是全血中的CRP質量濃度值，需要通過紅細胞壓積（HCT）建立血清體積和全血體積的修正因子，報告CRP血清濃度=CRP全血質量濃度/HCT，其測量結果的溯源需合并CRP和HCT兩個溯源路徑。血液分析儀一體機CRP血清濃度溯源量值圖如圖2所示。

2.2產品校準品定值

使用參考標準或工作校準品校準制造商標準測量程序，產品校準品通過重復測量，計算平均值得到靶值，并評估測量不確定度。產品校準品的不確定度應包括所有較高計量水平的測量程序和參考標準的不確定度分量總和。

2.3儀器、試劑的質量管理

儀器、試劑的制造質量易受物料質量、產品設計和生產制造水平等多種因素影響。邁瑞在設計開發時既充分考慮這些影響，為檢測系統的分析應用和性能設定目標，并在血液分析儀、試劑、校準品和質控品的生產和設計過程中，對檢測系統進行初始確認，確認方案參考CLSIH26-A2《自動血液分析的確認、驗證和質量保證》和《ICSH血細胞分析儀包括用于微分白細胞和網織紅細胞計數的評價指南》[6-7]而制定的。在實際工作中，會為每個檢測制定性能目標，通過遵循嚴格的來料檢驗、生產過程管理、出廠檢驗等質量體系管理要求，嚴格控制生產各個環節，確保出廠的血液分析儀臺間、試劑批間一致。血液分析儀使用的質控品、校準品，包括EQA室間質評樣本，因人血細胞保存困難，目前基本上都是經過處理的人源細胞、動物源細胞、人工合成物質模擬制備，所以無法避免基質效應的影響。所以在開發設計時會充分評估儀器型號間的差異，如果儀器型號間有明顯差異，會按儀器型號提供專有靶值，杜絕型號間差異對臨床結果的影響。而且筆者們也與衛生部臨檢中心等EQA組織持續保持溝通，對有差異的型號分組進行評價，避免對臨床儀器的錯誤評估。

3臨床實驗室檢測結果標準化

檢測結果準確是臨床診治的前提條件，理想情況下，同一患者樣本無論何時、何地，使用不同的血液分析儀檢測，測量結果都應該一致，只可能受生物學變異的影響。為達到此目標，最有效的手段就是減少分析過程中的誤差，包括溯源校準、質量控制兩大方面，這需要國際標準化組織、制造商和臨床實驗室的共同努力。校準通過調整儀器排除誤差，并通過質量控制保證儀器校準的穩定性。血液分析儀投入使用前必須經過校準，并且每半年或有需要時進行復校準[8]，確保了檢測結果的溯源性。邁瑞提供的校準品均滿足溯源性要求，并可為用戶提供規范的定期校準服務；用戶端也可直接使用廠家配套的校準品，按專有的校準界面，自行進行校準過程。同時，邁瑞為臨床實驗室積極開展質量控制活動提供完善的配套服務，包括室內質控和室間質評，其中參加室間質評費用較高，且受周期的限制，每半年或1年才能評估儀器狀態。為突破以上限制，邁瑞配套推出了MRHCP廠家實時在線質量控制平臺，利用室內質量控制數據進行實驗室間比對。通過該平臺，不僅能夠方便地獲得室內質控統計報告，而且可以實時與全球多家實驗室進行對比，評估儀器的準確度、精密度，促進實驗室檢測能力的提升。除校準和質量控制的影響外，其實際檢測結果準確性還受其他分析前、分析中、分析后很多環節的影響。在產品設計開發過程中，已充分考慮各種因素，確保在進樣系統、故障報警、維護保養等程序設計時維持儀器的最佳使用狀態。如流水線的進樣系統可以實現樣本自動條碼掃描，并按檢測項目自動調配上機，避免了樣本進樣錯誤。

4測量不確定度

測量結果的計量溯源性通過測量程序和校準物質交替的不間斷比較鏈（比較鏈可逐級向上減少測量的不確定度），實現計量學上的溯源性。某校準物質由給定校準水平的測量程序定值，應同時評估測量不確定度，此不確定度應包括所有較高計量水平的測量程序和參考標準的不確定度分量總和，即測量不確定度從上至下逐級增大，因此溯源過程應盡量減少中間傳遞過程。測量不確定度越小，表明實驗室測量的質量和能力越高。邁瑞所有檢測系統均提供有溯源性、帶有測量不確定度的配套產品校準品，用于臨床儀器校準，其中把測量不確定度作為靶值的一部分同時提供給用戶，包括所有較高計量水平的測量程序和參考標準的不確定度分量總和。由于對溯源過程非常了解，筆者們采用“自下而上”的方法評定的測量不確度，全面分析識別出每一個可能的測量不確定度來源，對重要的不確定度分量進行評估并合成校準品的測量不確定度。為保證臨床結果準確性，其測量不確度要求小于臨床要求的1/3。

5結束語

制造商在檢測結果標準化中扮演著重要的角色，每個制造商均建立有效的溯源傳遞，將有助于臨床檢測結果互認。制造商負責提供校準品和正確度控制品，作為體外診斷檢測系統的一部分，與儀器、試劑共同使用。邁瑞不僅建立了完善的溯源體系，同時指導用ERM-DA474/IFHCT參考方法CC制造商選定測量程序新鮮血工作校準品血液分析儀標準測量程序血液分析儀標準測量程序產品校準品CRP產品校準品血液分析儀血液分析儀HCT結果CRP全血質量濃度計算CRP血清質量濃度（CRP全血質量濃度濃度/HCT）戶端校準和質量控制的應用，在檢測結果標準化中履行了自身的職責。

參考文獻：

［1］Internationalorganizationforstandardization.ISO17511:2020Invitrodiagnosticmedicaldevices—requirementsforestablishingmetrologicaltraceabilityofvaluesassignedtocalibrators，truenesscontrolmaterials，andhumansamples［S］.Geneva:internationalorganizationforstandardization，2020.

［2］Internationalorganizationforstandardization.ISO/IEC17025:2017Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories［S］.Geneva:internationalorganizationforstandardization，2017.

［3］Internationalorganizationforstandardization.ISO15195:2018Laboratorymedicine—requirementsforthecompetenceofcalibrationlaboratoriesusingreferencemeasurementprocedures［S］.Geneva:internationalorganizationforstandardization，2018.

［4］馮仁豐.互換性依然是問題［J］.檢驗醫學，2013，12（1）：1063-1068.

［5］MILLERWG，BUDDJ，GREENBERGN，etal.Recommendationsforcorrectionofbiascausedbynoncommutabilityofacertifiedreferencematerialusedinthecalibrationhierarchyofanend-usermeasurementprocedure［J］.Clinicalchemistry，2020，66（6）：769-778.

［6］Clinicalandlaboratorystandardsinstitute.CLSIH26-A2validation，verification，andqualityassuranceofautomatedhematologyanalyzers；approvedstandard-secondedition［S］.Wayne，PA:clinicalandlaboratorystandardsinstitute，2010.

［7］BRIGGSC，CULPN，DAVISB，etal.ICSHguidelinesfortheevaluationofbloodcellanalysersincludingthoseusedfordifferentialleucocyteandreticulocytecounting［J］.Internationaljournaloflaboratoryhematology，2014，36：613-627.

作者:楊紅瑋 單位:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司